基于DNA的羊乳制品摻假檢測與信息管理系統開發

發布時間：2023-07-06 10:09

摘要 I

Abstract III

第一章文獻綜述 1

1.1我國乳品市場及安全狀況概述 1

1.2牛乳和羊乳的主要營養素差異 2

1.2.1牛乳和羊乳蛋白質差異 2

1.2.2牛乳和羊乳脂肪差異 2

1.2.3牛乳和羊乳維生素與礦物質差異 3

1.3國內外乳及乳制品摻假檢測研究進展 3

1.3.1基于蛋白質的檢測方法 3

1.3.2基于核酸的檢測方法 5

1.4國內外食品安全數據庫研究進展 7

1.5研究意義與內容 8

1.5.1研究意義 8

1.5.2研究內容 8

1 . 5 . 3特色及創新點 9

第二章基于DNA的羊乳產品中牛乳成分的定性和定量檢測方法及試劑盒開發11

2.1引言 11

2.2試驗材料與儀器 12

2.2.1試驗材料 12

2.2.2試驗試劑 12

2.2.3儀器和設備 13

2.3試驗方法 13

2.3.1DNA提取方法 13

2.3.2DNA濃度、純度、完整性檢測 14

2.3.3牛乳清粉DNA的靈敏度 14

2.3.4牛乳清粉DNA的檢測限 14

2.3.5 qPCR擴增效率和靈敏度 14

2.3.6定量標準曲線的制備 15

2.3.7方法準確性和重復性測試 15

2.3.8羊乳產品定性定量檢測試劑盒的研發 15

2.4結果與分析 15

2.4.1DNA質量評估結果 15

2.4.2牛乳清粉DNA的靈敏度 17

2.4.3牛乳清粉DNA的檢測限 18

2.4.4qPCR擴增效率和靈敏度分析 18

2.4.5qPCR測定牛乳清粉DNA的檢測限 19

2.4.6方法準確性和重復性分析 20

2.4.7羊乳產品定性定量檢測試劑盒的研發 21

2.5討論 25

2.6小結 26

第三章市售羊奶粉的DNA質量評價及牛乳摻假檢測 27

3.1引言 27

3.2試驗材料與儀器 27

3.2.1試驗材料 27

3.2.2試驗試劑 28

3.2.3儀器和設備 28

3.3試驗方法 28

3.3.1羊奶粉DNA提取方法 28

3.3.2羊奶粉DNA提取濃度、純度、完整性檢測 28

3.3.3羊奶粉中牛乳成分的普通PCR檢測 28

3.3.4羊奶粉中牛奶粉的qPCR檢測 29

3.3.5統計分析 29

3.4結果與分析 30

3.4.1羊奶粉DNA提取含量、純度、完整性結果 30

3.4.2羊奶粉中牛乳成分的普通PCR檢測結果 32

3.4.3羊奶粉中牛乳成分的qPCR檢測結果 33

3.5討論 35

3.6小結 36

第四章羊奶粉營養安全信息管理系統的設計與構建 37

4.1引言 37

4.2羊奶粉營養安全信息管理系統的設計開發 38

4.2.1系統規劃分析階段 38

4.2.2系統設計階段 39

4.2.3系統實施階段 41

4.2.4系統測試階段 42

4.3羊奶粉營養安全信息管理系統的運行與應用 42

4.3.1管理系統開發及運行環境 42

4.3.2管理系統的主要界面 43

4.3.3管理系統主要功能的實現 43

4.4討論 48

III

4.5小結 50

第五章結論與展望 51

5.1結論 51

5.2展望 52

參考文獻 53

致謝 65

攻讀學位期間的研究成果 67

英文縮略表

英文縮寫英文全稱中文名稱

DNA Deoxyribonucleic Acid 脫氧核糖核酸

PCR Polymerase Chain Reaction 聚合酶鏈式反應

實時熒光定量

qPCR Quantitative Real-time PCR PCR

Ct Cycle Threshold 循環閾值

RSD Relative Standard Deviation 相對標準偏差

CV Coefficient of Variation 變異系數

第一章文獻綜述

1.1我國乳品市場及安全狀況概述

近年來，我國的乳制品總產量和人均占有量穩步增長，總量更是處于世界排名中第三位，僅落后于印度和美國［1］。預計到2027年牛乳產量將較2018年增長22%，而牛乳產量的大部分增長預計將發生在發展中國家（80%）［2］。

重要的奶源中除了傳統牛乳外，還有近年來發展起來的羊乳。隨著人們對羊乳及其產品認可度的提升，羊乳產品被進一步豐富。液態羊乳是一種易腐敗的產品，通過干燥方法去除水分生產成羊奶粉，不僅能夠防止微生物的生長和抑制酶促反應，而且在無需冷藏的情況下仍具有較長保存期，方便貯存和運輸等，在國際乳制品貿易中占有較大比例的份額［3, 4］。根據數據顯示，從2008年到2014年，中國羊奶粉的市場銷售額從僅有3 億元增加到35 億元，并且幾乎保持每年 25%以上的市場增量，2015年更是突破了50億元，2018年，銷售額甚至增長至100億元，此外，預計2022年將突破480萬噸的羊乳制品產量［5］。隨著我國二胎、三胎政策的逐漸放開，也將為羊奶粉市場打開新的發展機遇［6］。

然而，由于乳品工業起步較晚，關于乳品質量標準以及衛生標準缺乏且不完善，法律監管、檢測方法和體系不健全，使乳及乳制品安全質量的可控性存在較大風險。 2008 年的三鹿奶粉中添加三聚氰胺導致嬰幼兒患上腎結石的事件［7］，伊利奶粉汞超標事件［8］，以及蒙牛奶粉中黃曲霉毒素超標事件［9］。發生的多起乳品安全事件嚴重打擊了中國消費者對國內生產安全乳品的信心，給我國乳品行業帶來了很大的負面影響，國內乳品產業遭受重創，黃金十年結束，開始進入了成熟期。此后，為了確保乳制品的質量安全、重建消費者對國內乳品生產安全的信心、維護乳品行業的健康長期發展，我國陸續規范了關于奶粉的監管制度、法律法規以及檢測標準，并提高保障產品的質量，使我國乳品質量得到了顯著提升。據《中國奶業質量報告（2017）》數據顯示，2016年的乳品抽檢合格率為 99.5%，抽檢嬰幼兒配方乳粉的合格率為98.7%。“三聚氰胺”在連續9年的抽檢中未檢出，表明我國乳品的安全質量持續穩中向好［10］。2021 年又對嬰幼兒配方乳粉提出了更高的標準要求，在公告中規定，嬰幼兒配方奶粉中乳蛋白應該來源于同一動物物種，若使用兩種或兩種以上動物性原料，必須在配料表中標示出每種動物性乳蛋白原料所占比例。該規定的出臺明確了羊乳制品的生產經營環境［11］。從以上乳品市場行業的發展來看，進行乳品安全與質量的規范與檢測研究，加強乳制品的質量管理和提升安全消費水平，不僅能夠滿足國民健康的需求，而且對穩固企業發展、提升社會經濟情況、促進經濟可持續發展具有非常重要的作用［1, 12］。

1.2牛乳和羊乳的主要營養素差異

1.2.1牛乳和羊乳蛋白質差異

山羊乳和牛乳都含有30~35 g/L的總蛋白質，由80%的酪蛋白和20%的乳清蛋白組成［13］。Ceballos等［13］在牛乳和羊乳最適條件下分別測得2.82%和3.48%的蛋白質含量，其中酪蛋白的總含量差異不大。牛乳中的主要蛋白質是as1 -酪蛋白和a-乳清蛋白，而山羊乳中的主要蛋白質組分由卩-酪蛋白、as2-酪蛋白和少量的as1 -酪蛋白組成［14］。對牛乳和山羊乳的蛋白質組分研究中發現兩者具有明顯差異，牛乳中的as1 -酪蛋白含量為12?15 g/L［15］,山羊乳中的這種蛋白質含量因基因型而異從 0.9?7.0 g/L,山羊奶中as1-酪蛋白的量占總蛋白質62.8%,顯著低于牛乳［13］。因as1- 酪蛋白較低，所以山羊乳具有更細、更軟的凝乳［16］，并且這種蛋白質較低水平可能有助于降低山羊乳的過敏性［17］。酪蛋白部分的比例不同，膠束特征在大小、水合和礦化方面也不同。與牛乳酪蛋白膠束相比，山羊乳酪蛋白膠束的礦化度更高，水合性和熱穩定性更低［18］，此外，山羊乳中酪蛋白膠束的鈣含量比牛乳中膠束的高，在羊奶酪的生產中無需添加CaCb,具有技術優勢［19］。乳清蛋白由3部分組成，分別是卩-乳球蛋白、a-乳白蛋白和血清白蛋白。羊乳中的乳清蛋白比牛乳中的乳清蛋白對加熱更敏感。據報道，羊乳在65 °C下巴氏殺菌30 min導致大約15%的水溶性蛋白質變性,而相同條件下,牛乳蛋白質只有2.3%發生變性［19］。

1.2.2牛乳和羊乳脂肪差異

羊乳和牛乳中的總脂肪含量和脂肪酸比例相似［13, 20, 21］，但羊乳和牛乳中存在的脂質類型有所不同。最近的一項脂質組學研究表明，羊乳的中鏈脂肪酸（6?14碳）的含量為28.8%，顯著比牛乳高，比長鏈脂肪酸更容易消化［13, 22］，與長鏈飽和脂肪酸相比，嬰兒則更容易吸收中鏈飽和脂肪酸［23］，這意味著羊乳脂肪在配方奶粉中可能是有利的，也可以被認為能夠為各種代謝過程提供極好的能量來源，甚至用于對抗代謝疾病。同時，山羊乳中的脂肪球平均直徑約為2 pm,而牛乳中的脂肪球平均直徑約為3 pm［24］，兩者相比，羊乳的脂肪球更小且均勻，其脂肪酸的鏈長更短，且短鏈脂肪酸含量高，而牛乳中長鏈脂肪酸含量高，因而提高了其消化能力［25］。另外，與牛乳不同的是，羊乳含有更多的中鏈脂肪酸（辛酸和癸酸）和支鏈脂肪酸，如 4-甲基-和 4-乙基-辛酸［13, 20, 26］，這些脂肪酸賦予了羊乳特有的風味［27］。

1.2.3牛乳和羊乳維生素與礦物質差異

山羊乳中的維生素A含量高于牛乳，由于山羊將所有卩-胡蘿卜素轉化成了維生素A,使色澤上山羊乳比牛乳更白［28］。山羊乳為嬰幼兒提供足量的維生素A和煙酸，以及過量的硫胺素、核黃素和泛酸鹽［29］。如果僅通過山羊乳喂養嬰幼兒，嬰幼兒的蛋白質、鈣、磷、維生素A、硫胺素、核黃素、煙酸就會超出世界衛生組織的要求［30］。與牛乳相比，山羊乳明顯缺乏葉酸和維生素B12,這兩種維生素在牛乳中的含量是山羊乳的 5 倍［31, 32］，如果嬰兒只喂食未添加這些成分的羊乳，則會發生巨幼紅細胞性貧血［33, 34］，因此羊乳和牛乳的礦物質和維生素水平必須針對嬰兒配方奶粉進行調整。Mcclenathan等［35］發現山羊乳和牛乳都缺乏吡哆醇（B6）、維生素 C 和維生素 D。

山羊乳含有約134 mg/g鈣和⑵mg/g的磷。山羊乳中的鈣、磷、鎂和銅的含量顯著較高于牛乳，分別為 17.4%、 15.6%、 16.3%和 66.6%［13］，而鈉和硫的含量則低于牛乳［28］。

1.3國內外乳及乳制品摻假檢測研究進展

1.3.1基于蛋白質的檢測方法

1.3.1.1電泳法

電泳技術是根據帶電粒子在電場中因不同的移動速度而達到分離目的的一種分離方法。目前，常見用于摻假檢測的蛋白質電泳技術主要包括十二烷基硫酸鈉- 聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE ）和毛細管電泳（Capillary electrophoresis, CE）等。

SDS-PAGE是一種常規的電泳技術，用于確定單個蛋白質和肽的分子量，被廣泛應用于醫學、農林和食品等領域［36-38］。Marzo等［39］通過SDS-PAGE分析發現，牛乳中的大部分（89%）酪蛋白水解產物保留在凱氏定氮非酪蛋白氮沉淀物中。 Sharma等［40］開發了一種用于檢測糖巨肽和卩-乳球蛋白的簡單方法，該方法可以用于奶酪乳清中大分子的鑒定和牛乳中摻入凝乳酶乳清的檢測。

與聚丙烯酰胺凝膠電泳相比，毛細管電泳通過紫外吸收來實現對蛋白質的檢測，不需要繁雜的染色和脫色。Recio等［41 ］通過毛細管電泳分析了商業UHT奶、純牛奶和摻有凝乳酶乳清的牛奶樣品，可以檢測到添加到牛奶中的凝乳酶乳清固體。Neves等［42］提出了一種紫外間接檢測毛細管區帶電泳定量測定UHT牛奶中乳糖和乳果糖的新方法，得到乳糖和乳果糖定量限分別為 0.024 g/100mL 和 0.0094 g/100mL。Trimboli等［43］通過利用牛a-乳白蛋白作為標志物來檢測和量化水牛奶中的牛奶，可檢測到的假冒牛奶的最低含量為1%，定量限為3.1%。

1 . 3 . 1 . 2酶聯免疫吸附

酶聯免疫吸附也被稱為ELISA，它是把具有強特異性的抗原抗體反應和高效性的酶催化作用相結合的一種檢測技術，不僅可以檢測抗原，還可以檢測抗體。在乳及乳制品摻假檢測中，主要將酪蛋白、免疫球蛋白、乳清蛋白或者乳球蛋白等作為目標抗體oSong等［44］針對卩-酪蛋白的抗體，可量化濃度在2%?50%的摻假牛乳，實現羊酪蛋白、原奶和熱處理奶2%的檢出限。Ren等［45］使用了抗牛卩-酪蛋白單克隆抗體用于檢測1%~80% (vol/vol)牦牛乳中的牛卩-酪蛋白和牛乳，實現了牦牛乳中 1%牛乳的最低檢出限。

1.3.1.3 光譜法

光譜技術作為一種檢測過程中不破壞樣品物化性質的無損且快速檢測的新興方法。根據樣品不同的構造和物化性質，引起不同的特征譜線信息以鑒別物質和確定其化學組成［46］。該方法通常需要結合包括光譜的預處理和模型的建立的化學計量方法來分析［47］。Rahat等［48］采用拉曼光譜根據卩-胡蘿卜素的存在和不存在成功區分了牛奶和水牛奶。Paulo等［49］使用漫反射光譜法成功應用于牛奶樣品中尿素的分析。Fazal等［50］研究了新的NIR光譜結合多變量分析對駱駝奶摻入山羊奶的檢測和定量分析，實現了良好的重現性、高靈敏度， 0.5%的檢測限，定量限為 2%的方法。

1.3.1.4色譜法

色譜技術又稱為層析技術，在近十幾年中已被認為是食品質量分析中分離樣品最有效的手段。目前，色譜技術涉及高效液相色譜（HPLC）、氣相色譜（GC）、薄層色譜（TLC）和超臨界流體色譜（SFC）等［51］。通常高效液相色譜、氣相色譜被應用于乳及乳制品方面的檢測。由于色譜與質譜聯用具有保留時間、可獲得質量以及強度三維信息的優點［52］，所以被廣泛的應用于乳及乳制品的檢測。目前已經報道了液相色譜用于從牛、山羊和綿羊奶中分離主要蛋白質［53］。此外液相色譜-串聯質譜和基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜已經應用于特征蛋白質和肽的定性和定量分析［54, 55］。 Tan 等［56］建立了一種使用超高效液相色譜四級桿飛行時間質譜的非靶向代謝組學方法，發現了可用于對 UHT 和復原乳進行分類的生物標志物。 Anastasia 等［57］描述了使用高效液相色譜法測定牛乳中過氧化氫的方法，得到檢出限為 0.28 mg/L。

1.3.2基于核酸的檢測方法

1.3.2.1 聚合酶鏈式反應

聚合酶鏈式反應（PCR）是一種常用的方法，可生成由一對寡核苷酸或引物引起的目標脫氧核糖核酸片段的多個拷貝。作為一種可靠且廉價的技術， PCR 技術已經在多個科學領域得到廣泛的應用，例如醫學診斷、食品安全檢測、農業等［58- 60］oPCR最初是作為一種定性分析來回答基因分析的是或否問題，通常通過凝膠電泳檢測PCR擴增條帶的存在或不存在。獲得的數據一般只能解釋為“陽性（可檢測）”或“陰性（不可檢測）”，如果想要半定量測定，則需要通過將常規PCR與凝膠電泳相結合來進行的，以通過凝膠條帶的熒光強度大致評估 PCR 產物的量［61］。劉永峰等［62］發明了 PCR 技術對羊奶粉中牛乳成分進行半定量和精準定量的方法。 Abdel-Rahman 等［63］提出了一種 PCR 和 PCR-RFLP 分析適用于檢測和鑒定奶種特異性的快速和靈敏的方法。

1.3.2.2實時熒光PCR技術

實時熒光PCR （qPCR）在各個領域都有應用，被認為是分子和基因組研究中必不可少的技術。由于該技術可以通過比較靶基因（分析物）與管家（參考）基因的表達進行相對分析，還可以通過運行標準系列進行絕對測量已知濃度［61］。因此該方法不僅廣泛用于基因表達、微生物、拷貝數的絕對定量和相對基因表達分析［64］，還被經常用作檢測、鑒定、量化和基因分型微生物的方法，作為診斷、食品質量控制和安全的輔助手段［65］。qPCR結合熒光染料使監測模板擴增具有更高的靈敏度和特異性。SYBR Green作為使用最廣泛的熒光染料之一，盡管相對便宜易于使用，但能夠與任何雙鏈DNA發生結合的特點則成為它的一個缺點，因為會引發非特異性結合而產生熒光［64］。TaqMan探針也通常用作特異性檢測qPCR測定的熒光報告基因［66］。然而，設計探針既困難又昂貴［67］，因此，基于SYBR的絕對和相對量化是必不可少的。Lopez-Calleja等［68］利用線粒體12S核糖體RNA基因，通過熒光探針(TaqMan)確定混合物中牛乳的百分比，證明了在0.5%~10%范圍內該方法具有檢測和量化牛乳的特異性和敏感性。Alessandra等［69］開發了 TaqMan qPCR區分驢奶中2%的牛奶。Hai等［70］開發了一種基于線粒體12S核糖體DNA擴增的三重qPCR方法用于鑒定乳制品和肉制品中駱駝和奶牛來源。

1.3.2.3數字PCR技術

數字PCR (dPCR)技術的樣品是通過將已經具有引物和DNA模板的PCR預混液經過有限稀釋后，由液滴發生器通過使用與水不混溶的礦物油相互分離成數千到數萬滴液體，并分配到大量獨立的分區中，這樣每個分區理想地包含0到1 個目標 DNA 拷貝，經過 PCR 擴增后，以泊松統計并校正總陽性反應后，不僅可以得到目標 DNA 的濃度，還可以得到目標分子的絕對數量［71, 72］。與 qPCR 相比， dPCR采用絕對定量，是一種直接定量方法，無需標準曲線即可計算“陽性”反應的數量［61］。然而，該技術為近些年新興技術，無論是儀器還是試劑，檢測成本太高，并沒有被普遍的應用。目前，主要應用于醫學研究、微生物等［73, 74］，在食品、乳及乳制品檢測方面研究甚少。

1.3.2.4環介導等溫擴增技術

環介導等溫擴增(Loop-mediated isot hermalamplification, LAMP)技術是一種在等溫條件下擴增DNA的核酸擴增技術［75］,無需熱循環儀和信號檢測，只需要一組4個或6個特定設計的引物和一個具有鏈置換活性的DNA聚合酶等，可將DNA 擴增 109個拷貝，而不會影響特異性，并且能夠使用特定染料對擴增的目標進行視覺檢測。常用的檢測方法包括濁度法、瓊脂糖凝膠電泳法、可視化檢測和紫外光檢測法［76］。其中通過可視化和紫外光等方法觀察檢測結果，可以縮短檢測的時間，同時還可以減少氣溶膠對周圍環境的污染oLee等［77］提出了用于鑒定何首烏的LAMP 方法，該方法靈敏度比PCR提高了 10倍且只需要PCR 一半的時間。Wang等［78］

通過LAMP檢測摻有牛奶的山羊奶，靈敏度低至10 fg，檢出限達到0.01%。Shi等［79］將LAMP與橫向流動試紙或羥基萘酚藍染料相結合，30 min可完成反應，檢出限為0.1%，靈敏度可達3 pg。根據目前已經研究的LAMP試劑盒和開發了凍干形式的 LAMP 試劑， LAMP 將發展成為一種可作為即時檢測的方法［76］。

1.4國內外食品安全數據庫研究進展

隨著互聯網在食品安全數據管理方面的應用發展，食品數據網絡管理系統越發重要。食品數據網絡技術的快速發展和不斷完善為我們分析食品安全問題提供了幫助。數據管理系統的運用不僅可以精準化增強食品安全監管的力度，也能夠幫助我們分析判斷食品安全出現的問題。目前，大量的食品安全數據分析及監管方式正一步步朝著網絡化變革，這也意味著計算機技術在食品信息管理中將成為食品品質研究分析和監管的主流方向。近年來，基于信息管理系統的食品安全檢測、監管的方式越來越多。 Hu 等［80］為提高食品安全監管技術支撐系統的風險識別能力，建立了基于高效液相色譜/高分辨質譜、互聯網、大數據等技術的食品風險物質篩查平臺，為食品安全風險管理提供新的技術和手段。Zhao等［81 ］建立并收集了 1730 種已知益生菌，提供用于人類、動物和植物的生物學信息，不僅可以提供經驗數據，而且以便于更好地理解和應用生物信息學研究。 Donarski 等［82］認為在創建食品真實性數據庫時必須解決的最重要的問題包括數據庫范圍、分析方法、采樣、數據收集和存儲、驗證和管理等領域。在國內，食品安全數據信息管理系統也正在被重視和運用。陳婷等［83］提出了主要應用于實驗室的對食品安全檢測信息化管理系統的架構方案，不僅對食品安全檢測能夠提升綜合服務能力，還能對食品安全質量的控制及風險監測加以完善。何敏等［84］設計并建立了中藥數據庫，實現能夠將中藥數據批量添加到數據庫中的方法。

目前所知奶粉相關管理系統有奶粉倉儲管理系統、奶粉銷售管理系統、奶粉溯源管理系統等。食品安全管理中數據的相關性對乳制品企業來說越來越重要，將計算機技術應用到羊奶粉安全品質研究分析和監管中，通過對比篩選和分析大量的羊奶粉營養安全數據，可以識別、預測不同羊奶粉營養安全間存在的差異，及時應對和解決羊奶粉質量存在的問題，能夠很大程度上提升對羊奶粉品質監管的科學化水平，幫助企業根據羊奶粉品質數據庫信息提高羊奶粉生產加工品質，提高企業競爭力。如果羊乳行業數據共享，羊乳行業的發展將受益匪淺，這將有助于開展產業鏈優化研究，也有助于提高羊乳質量監管和防偽。羊奶粉成分數據庫作為描述羊奶粉營養特征的基礎信息，是一個地區、行業必須的公共衛生數據、基礎戰略資源，也是衡量羊奶粉營養科學水平的重要標志之一，在引導羊奶粉生產、指導羊奶粉加工、平衡各地區貿易等方面都發揮著重要作用。

1.5研究意義與內容

1.5.1研究意義

羊乳作為陜西省極具優勢的特色產業，近年來政府加大了產業政策扶持， 2021 年監管部門又提出了嬰幼兒配方乳粉產品的規范公告，標志著羊乳及其制品將逐漸由數量向質量轉變。羊乳作為一種受養殖和季節波動影響較大的乳品，其產量低于牛乳，價格高于牛乳，使得部分商家為了降低成本，尋求商業利益，在產品標簽未注明的情況下在羊乳產品中加入牛乳成分。另外，新發布的嬰幼兒配方乳粉產品規定的公告中表示“牛羊混合”奶粉或“半羊”奶粉，應當在配料表中如實標明動物性來源。此外，羊乳雖然是一種比較小眾的乳品，但隨著消費者可接受度和認可度的提高，羊乳及其制品的營養、安全、健康等越來越受到人們的注重。為了使消費者對市售羊奶粉的營養及安全品質有清楚的了解和認知，使羊奶粉生產商能把控羊奶粉的健康安全生產，使食品安全監管部門能夠更加全面的監控和管理羊奶粉的品質安全，本研究主要以羊乳及羊乳產品中牛乳成分為探索對象，采用基于 DNA的分子生物學方法開展羊乳產品的純正性檢測，并建立羊奶粉營養安全信息管理系統。

1.5.2研究內容

（1）基于 DNA 的羊乳產品中牛乳成分定性和定量檢測方法研究及試劑盒開發。

用改進的乳清粉DNA提取方法提取乳清粉DNA,研究并建立普通PCR定性和 qPCR 定量檢測牛乳成分的方法，在此基礎上開發了分別針對羊乳清粉和羊奶粉的定性定量檢測試劑盒，并從外觀、試劑盒組成、具體操作步驟、結果判斷以及注意事項等對試劑盒進行了詳細的說明。

（2）市售羊奶粉的DNA質量評價及牛乳成分摻假檢測。

對市售的包括純羊奶粉和配方羊奶粉的38種國內外羊奶粉中進行DNA質量（濃度、純度、完整性）的比較分析，采用普通PCR技術測試牛乳成分的檢測限，采用qPCR技術檢測牛乳成分的靈敏度，然后對38種羊奶粉進行定性和定量檢測。

(3)羊奶粉營養安全信息管理系統的設計與構建。

基于B/S架構和MySQL數據庫，以Java作為系統主要開發語言，建立了羊奶粉營養安全信息管理系統，實現系統注冊登錄、數據增刪改減、快速查詢、 DNA 數據庫、電子鼻和電子舌圖譜庫、產地判斷等主要功能作用。

1.5.3特色及創新點

(1)首次針對乳清粉，建立了羊乳清粉中摻假牛乳成分的定性和定量檢測方法，并設計開發了羊乳產品中摻假牛乳成分的定性定量檢測試劑盒。

(2)對市售的38種國內外羊奶粉的DNA提取質量進行分析和羊奶粉純正性定性定量檢測，探究了純羊奶粉和配方羊奶粉提取的DNA質量的差異，檢驗了羊奶粉的真實性以及摻入牛乳成分的含量。

(3)建立了羊奶粉營養安全信息管理系統，可實現羊奶粉具體營養成分的快速、準確搜索，獲取不同種類、地區間羊奶粉營養安全品質差異情況。

第二章基于DNA的羊乳產品中牛乳成分的定性和定量檢測

方法及試劑盒開發

2.1引言

乳清保留了牛乳中約 55%的營養成分，是一種流行的膳食蛋白質補充劑，已成為具有高價值及廣泛應用的食品原料。近年來，國家針對嬰幼兒配方奶粉中乳清蛋白制定了含量應高于 60%的規定。羊奶粉生產企業可以使用牛乳清粉代替羊乳清粉來生產奶粉，但應該如實標明使用乳制品原料的動物性來源。因此，乳清粉常被用于嬰幼兒配方奶粉和醫用營養配方等奶粉中［85］。乳清粉作為嬰幼兒配方奶粉的主要成分之一，占比 40%~50%，可將乳清蛋白與酪蛋白比值調整為接近 60:40 的人乳比例［86］。牛乳清粉和羊乳清粉的蛋白質組成差異雖然不大，但產量上有明顯差距［87］。由于中國大部分的乳清粉是從國外進口的，并且羊奶的季節性以及羊乳清粉商業生產的局限性影響了羊乳清粉的價格和產量［88］，使羊乳清粉價格高于牛乳清粉，成為有吸引力的摻假目標［89］。對牛乳過敏的人如果食用了含有牛乳清粉的純羊乳制品，可能對生命健康造成威脅。因此，有必要對羊乳產品的真偽和現有牛乳成分的污染和造假進行調查和檢測。

目前,Maria等［90］利用酶聯免疫法在脫脂奶粉中牛凝乳酶乳清的檢出限為0.1%； Ke等［89］建立的一種超高效液相色譜串聯質譜方法能夠在嬰幼兒配方奶粉中區分山羊或綿羊牛乳清與全脂奶粉，且評估嬰幼兒配方奶粉實際檢測中的摻假成分； De Oliveira Mendes 等［91］采用牛乳和乳清的 6 種脂肪酸在短時間內通過毛細管區帶電泳定量摻入的乳清；De Oliveira Mendes等［92］還提出了另一種使用拉曼光譜檢測和量化牛乳中乳清的存在。以上研究人員都是以脂質或蛋白質作為目標分析物。然而，乳清粉在生產中經過巴氏殺菌、蒸發、干燥等加工過程后蛋白質會發生熱變性［93］，使可識別蛋白質的數量減少約20%［94］。相比之下，DNA分子生物學方法在檢測加工乳制品中能夠保持更好的靈敏度。但是基于DNA的乳清粉摻假檢測的研究鮮有報道。

綜上，本研究采用改進的乳清粉DNA提取方法，對DNA質量進行了評價，并通過PCR技術來定性定量牛乳清粉的摻假，確保檢測的準確性和重復性，為羊乳產品中牛乳成分的鑒定提供一種現實有效的方法。

2.2試驗材料與儀器

2.2.1試驗材料

新鮮羊乳和牛乳采集于西安市當地農場。將所有鮮乳樣品分裝到 50 mL 離心管并置于冰盒中運送回實驗室，存放至-80 °C冰箱中備用。羊乳清粉和牛乳清粉的制備：將200 mL生鮮牛、羊乳分別分裝到10 mL離心管中，在4 C下以5000 r/min 的轉速離心30 min,去除上層脂肪，在72 C下進行15 s熱殺菌。然后，將脫脂牛乳和羊乳的 pH 值分別調節至 4.6 和 4.1，在室溫下靜置 1 h 以去除酪蛋白。再以 3000 r/min的轉速離心15 min，收集上清液。脂肪球通過0.45 yL的濾膜過濾，乳糖通過5000 Da超濾膜去除。再將所得乳清浸入63 C水浴中滅菌30 min。最后，通過真空冷凍干燥獲得乳清粉，在-36 C下保存。

二元混合牛羊乳清粉的制備：制備羊乳清粉中分別包含 0.05%、 0.1%、 0.5%、 1%、5%和10% （W/wt）牛乳清粉，然后在-36 C下保存。

2.2.2試驗試劑

本研究所用的常規試劑、分子試劑信息見表 2-1，試驗所用引物見表 2-2。

表 2-1 主要試劑

Table 2-1 The main reagent

試劑名稱

氯仿、異戊醇、無水乙醇

氫氧化鈉（NaOH）、氯化鈉（NaCI）、

乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）、十二烷基硫酸鈉

（SDS）、Tris-HCI、

瓊脂糖、6xDNA Loading Buffer、Marker I DNA

Ladder、2xEs Taq MasterMix、、蛋白酶 K、Ultra

SYBR Mixture、 Bio DL 2000

DNA 提取酚

50xTAE buffer、引物、PBS 緩沖液

EB、 TE 緩沖液

表 2-2 引物序列

Table 2-2 Sequences of the primers

引物引物序列（5 J3'）片段大小（bp）參考文獻

Bos-Cytb F: GCCATATACTCTCCTTGGTGACA

271 Tartaglia 等[95]

R: GTAGGCTTGGGAATAGTACGA

F: TATTAGGCCTCCCCCTTGTT

ATP6 294 Liao 等[96]

R: CCCTGCTCATAAGGGAATAGCCC

2.2.3儀器和設備

本章研究的主要儀器設備見表2-3。

表 2-3 主要儀器與設備

Table 2-3 The main instruments and equipment

儀器名稱型號生產廠商

實時熒光定量PCR儀 CFX Connect Optics Module BIO-RAD

梯度PCR儀 T100 Thermal Cycler BIO-RAD

凝膠成像儀 UVCI-1100 Major Science

超微核酸分析儀 ND-1000 美國熱電公司

高速冷凍離心機 TGL-16aR 上海安亭科學儀器廠

水平電泳儀 DYY-4C 北京六一儀器廠

臺式小型離心機 1-14K Sigma-Aldrich

數顯恒溫水浴鍋 HH-4 江蘇金壇友聯儀器研究所

2.3試驗方法

2.3.1DNA 提取方法

基于實驗室前期研究方法［96］并改進后進行DNA提取。

2.3.2DNA 濃度、純度、完整性檢測

DNA 濃度和純度具體測定方法參照劉永峰等［97］相應檢測方法。 DNA 完整性檢測則按照王一凡等［98］方法進行。

2.3.3牛乳清粉 DNA 的靈敏度

為了測定普通PCR對乳清粉中提取的DNA的檢測靈敏度，以牛乳清粉DNA 為對象，用TE緩沖溶液以10倍梯度將基因組DNA從50 ng/yL連續稀釋到5 pg/yL。然后用表2-2中的Bos-Cytb引物，采用普通PCR反應體系及擴增條件重復3次PCR擴增。

普通PCR反應體系：將3.4 yL的2xEs Taq MasterMix、各0.3 yL的上下游引物、1 yL的DNA模板混合均勻，用ddH2O補齊至10 yL。擴增條件為：經95 °C 預變性 5 min；再 94 C變性 30 s，60 C (12SBT-REV、Bos-Cytb) /58 C (ATP- 6)退火30 s，在72 C下延伸30 s，該過程重復30個循環；最終在72 C總延伸10 min。普通PCR反應產物的檢測同2.3.2中瓊脂糖凝膠電泳檢測方法一致。

2.3.4牛乳清粉 DNA 的檢測限

將牛乳清粉按照10%、 5%、 1%、 0.5%、 0.1%和0.05%的比例與羊乳清粉進行均勻混合，以驗證牛乳清粉的摻假檢出限。從以上二元混合乳清粉中按照2.3.1 中的方法提取DNA,純牛乳清粉和羊乳清粉的DNA模板分別作為陽性對照與陰性對照，DNA模板均使用100 ng/yLo所用引物與擴增條件同233。所有試驗重復3 次。

2.3.5qPCR擴增效率和靈敏度

為了確定qPCR對Bos-Cytb引物對的擴增效率和靈敏度，將牛乳清粉DNA濃度按照10倍梯度從100 ng/yL稀釋到0.01 ng/yL,使用表2-2中的Bos-Cytb引物對，進行定量PCR擴增，qPCR反應體系為：5 yL 2xUltal SYBR Mixture,上游及下游引物各0.3 yL, DNA模板1 yL,剩余體積用dd^O補齊至10 yL。擴增條件為：95 C預變性10 min； 95 C變性10 s, 60 C退火30 s, 72 C延伸30 s, 40個循環。每個樣品重復測定3次。將初始DNA濃度的對數值作為橫坐標，得到的周期閾值(Ct)作為縱坐標，構建靈敏度標準曲線，擴增效率根據斜率由以下公式計

算得到：

擴增效率(％) = [io(-1/斜率)—l]x100 (1)

2.3.6定量標準曲線的制備

將牛乳清粉和羊乳清粉按照2.3.4方法進行二元混合并提取DNA, DNA模板均使用100 ng/yL。所用反應體系和擴增條件同2.3.5o所有試驗重復3次，得到的牛乳清粉含量百分比的對數為 X 軸，相應獲得的 Ct 值為 Y 軸，構建定量標準曲線。

2.3.7方法準確性和重復性測試

該方法的準確性通過對0.1%、0.5%和1%二元混合物乳清粉模型(n=10)的重復DNA分析確定。計算相對偏差和變異系數以反映qPCR方法的準確性和精密度。同時，對真實值和實測值進行T檢驗以評價定量標準曲線的有效性。此外，對DNA

(100 ng/yL)按照1:10、1:100、1:1000和1:10000稀釋，分別在3天進行重復分析，計算Ct值的相對標準偏差以反映方法的重復性。

2.3.8羊乳產品定性定量檢測試劑盒的研發

分別對羊乳產品摻假牛乳成分檢測試劑盒從包裝、組成進行設計，對試劑盒使用的具體步驟、結果判斷以及注意事項進行詳細說明。

2.4結果與分析

2.4.1DNA 質量評估結果

2.4.1.1DNA產量和純度

為了使提取的DNA在摻假檢測中獲得最佳的結果，通常需要特定的DNA濃度和純度。從乳清粉樣品中獲得的DNA濃度范圍為122?179 ng/yL, OD260/280值為 1.53~1.75。

2.4.1.2 DNA 完整性

從不同比例的牛、羊乳清粉二元混合物中提取的總DNA的完整性結果如圖2-

1所示。所有經過加工乳清粉樣品的基因組DNA條帶模糊，清晰明亮度一般，但

整體性較好，略有輕微拖尾現象，說明從乳清粉中提取出了 DNA。

圖 2-1 不同比例牛乳清粉和羊乳清粉的 DNA 瓊脂糖凝膠電泳圖

Fig. 2-1 DNA agarose gel electrophoresis of different proportions of bovine whey powder and goat

whey powder.

注：泳道 1-8 分別代表 10%、5%、1%、0.5%、0.1%、0.05%和純牛乳清粉和羊乳清粉。 Note: Lane 1-8 represent 10%, 5%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05% and pure bovine whey powder and goat whey powder respectively.

使用特異性引物對加工后的乳清粉進行擴增，獲得的擴增結果如圖 2-2所示。使用牛和羊特異性引物分別對牛和羊乳清粉進行擴增，獲得的目標片段條帶清晰單一，該結果表明引物特異性較好，且DNA經酸、堿和熱處理被破碎成小片段后，經 PCR 擴增仍可用于物種鑒定。

圖2-2牛乳清粉和羊乳清粉擴增牛(A)和羊(B)特異性引物的結果

Fig. 2-2 Results of amplification of bovine (A) and goat (B) specific primers from bovine whey and goat whey 注：泳道1代表牛乳清粉，泳道2代表羊乳清粉。

Note: Lane 1 and Lane 2 represent bovine whey powder and goat whey powder.

2.4.2牛乳清粉 DNA 的靈敏度

牛乳清粉DNA從50 ng/yL連續10倍稀釋到0.0005 ng/yL后的PCR擴增結果如圖2-3所示。隨著牛乳清粉DNA濃度的降低，所得到的牛特異性條帶清晰度及亮度也逐漸降低，直至泳道6條帶消失。泳道5 的目標條帶清晰度非常弱，檢測到的牛乳清粉DNA為0.005 ng/yL，然而重復性結果較差，表明普通PCR檢測牛乳

清粉 DNA 的靈敏度可達到 0.05 ng/yL。

圖 2-3 PCR 檢測牛乳清粉靈敏度

Fig. 2-3 PCR detection of sensitivity of bovine whey powder

注：泳道 1-6 分別代表 50 ng/yL、 5 ng/yL、 0.5 ng/yL、 0.05 ng/yL、 0.005 ng/yL 和 0.0005 ng/yL 的牛乳清粉DNAo

Note: Lane 1-6 represent 50 ng/yL, 5 ng/yL, 0.5 ng/yL, 0.05 ng/yL, 0.005 ng/yL and 0.0005 ng/yL bovine DNA, respectively.

2.4.3牛乳清粉DNA的檢測限

普通PCR對乳清粉二元混合物的檢測限結果如圖2-4所示。隨著牛乳清粉混合比例的減少，目標條帶的清晰度和亮度也相繼降低。泳道6代表的0.05%含量牛乳清粉的DNA目的片段沒有被擴增出來，泳道5可以觀察到輕微的目標條帶，因此，普通PCR最低能檢測出0.1%的牛乳清粉含量。

圖 2-4 PCR 檢測羊乳清粉中牛乳清粉含量的檢測限

Fig. 2-4 LOD of bovine whey powder in goat whey powder by PCR

注：泳道 1-8 分別代表 10%、5%、1%、0.5%、0.1%、0.05%含量牛乳清粉和陰性對照、陽性對照。

Note：Lane 1-8 represent 10%, 5%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05% bovine whey powder and negative control and positive control, respectively.

2.4.4qPCR擴增效率和靈敏度分析

為了更好的對羊乳清粉中摻入的牛乳清粉進行定量分析，在普通PCR定性檢測后，采用qPCR方法對Bos-Cytb引物進行靈敏度分析。將牛乳清粉DNA從100 ng/yL連續10倍稀釋至0.01 ng/yL，獲得的Ct值與初始DNA濃度的對數值構建的標準曲線如圖2-5所示，DNA濃度在100 ng/yL至0.01 ng/yL之間時相關系數為R2=0.9943,具有良好的線性關系，標準曲線斜率為-3.155,擴增效率為107.5%, 符合 qPCR 擴增效率的要求，表明 DNA 濃度在此范圍內的檢測結果較為可靠， qPCR最低檢測牛乳清粉DNA的濃度為0.01 ng/yL,高于普通PCR0.05 ng/yL的檢測靈敏度。結果表明，Bos-Cytb引物具有較高的檢測靈敏度，可以進一步應用于定量檢測分析。

log initial DNA amount (ng)

圖2-5 qPCR檢測牛特異性引物的靈敏度

Fig. 2-5 Sensitivity of bovine-specific primers detected by qPCR

2.4.5qPCR測定牛乳清粉DNA的檢測限

為方便準確量化二元乳清粉混合物中的牛乳清粉含量，含有0.1%、0.5%、1%、 5%、 10%和 30%的牛乳清粉被測定，構建的定量標準曲線如圖 2-6 所示。牛乳清粉含量在0.1%至30%范圍內的線性相關系數為R2=0.9858，高于qPCR檢測的最低性能標準 0.98，這表明牛乳清粉含量在 0.1%至 30%內可以用該標準曲線進行定

圖2-6 qPCR對羊乳清粉中不同含量牛乳清粉定量檢測的標準曲線

Fig. 2-6 Standard curve of qPCR for quantitative. detection of different contents of bovine whey

powder in goat whey powder

2.4.6方法準確性和重復性分析

因乳清粉加工的影響，目標分析物含量較低，增加了 qPCR檢測的難度，為確定結果的準確性和可重復性，選取了 0.1%、 0.5%和1%的混合物進行測定，準確性分析結果如表2-4所示。牛乳清粉含量越高，測定結果的相對平均偏差和變異系數越小。除0.1%外，其余2種含量的變異系數都接近于或小于5%，通常變異系數小于5%被認為是可接受的［99］。另外，T檢驗結果顯示只有0.1%水平下的實際值與實測值存在顯著性差異，這可能是由于 DNA 濃度低造成的，這意味著 0.1%的定量檢測存在一定的誤差。總之，以上結果表明具有相對的可靠性和一致性。

表 2-4 qPCR 對羊乳清粉中牛乳清粉含量檢測的準確性結果

Table 2- 4 The reliability of qPCR detection of bovine whey powder in goat whey powder

實際值實測值相對平均偏差

（準確度）變異系數

（精密度） P 值

（T 檢驗）

0.1% 0.06% 46% 55.5% 0.047

0.5% 0.66% 5.3% 5.54% 0.222

1% 0.9% 3.1% 3.42% 0.068

表2-5為100 ng/yL的牛乳清粉DNA經過10倍連續稀釋至0.01 ng/yL，分別在 3 天進行了重復性測試。所有結果的相對標準偏差都小于食品和藥物管理局規定的5%,表明qPCR對牛乳清粉DNA測定具有良好的重復性。

表 2-5 qPCR 對牛乳清粉 DNA 測定的重復性結果

Table 2-5 The repeatability of DNA determination of bovine whey powder by qPCR

稀釋倍數 DNA 濃度

(pg/yL) 第1天 Ct值相對標準偏差

第2天第3天

1:10 10000 25.70 25.14 25.27 1.16%

1:100 1000 28.34 28.20 28.13 0.38%

1:1000 100 31.24 31.46 31.19 0.46%

1:10000 10 34.18 33.64 31.70 3.93%

2.4.7羊乳產品定性定量檢測試劑盒的研發

2.4.7.1簡介

羊乳產品摻牛乳成分的檢測試劑盒包括羊乳清粉和羊奶粉真實性檢測試劑盒。兩種檢測試劑盒中各含有其特異性引物，將普通PCR與qPCR兩種方法相結合可以對羊乳清粉或羊奶粉產品進行快速、高效的擴增檢測。該系列試劑盒錯配率低，反應體系穩定，重復性強，擴增產物得率高，使用操作簡便快捷，并可最大限度地減少人為誤差和污染。

2.4.7.2試劑盒包裝及組成

（1）試劑盒的包裝

試劑盒的外包裝圖及試劑組成圖如圖 2-7 所示。包裝盒采用立方體盒子，表面標有試劑盒名稱、規格、有效期、儲存條件等產品信息，其次在試劑瓶上標有試劑編號、規格及儲藏條件。該試劑盒可承載十幾管多種規格的試劑瓶，盒內內置有海棉內襯，可將各規格試劑瓶分區放置并固定，避免在運輸和使用過程中試劑瓶被打亂的情況。

圖2-7羊乳產品系列摻假檢測試劑盒外包裝圖（A）、試劑組成圖（B）、試劑盒內部圖（C）

Fig. 2-7 The outer packaging diagram of the adulteration detection kit for goat milk products （A）, the composition diagram of the reagent （B）, and the inner diagram of the kit （C）

（2）試劑盒的組成在保證試驗結果有效、準確的前提下，將每個反應體系的總量盡可能降低，以減少試劑的浪費，降低檢測成本。

A. 羊乳清粉摻牛乳成分的定性定量檢測試劑盒的組成

羊乳清粉摻牛乳成分的定性定量檢測試劑盒為50次用量，由5 部分組成，

主要成分見表 2-6。

表 2-6 羊乳清粉摻牛乳成分的定性定量檢測試劑盒的組成

Table 2- 6 The composition of the qualitative and quantitative detection kit for goat whey powder mixed with bovine components

編號包裝（50次測試）保存方式使用方法

A1 170 yLX1 支

A2 500 yLX1 支使用時充分

A3 600 yLX1 支 -20 °C 融化

牛特異性引物對（I）共2支（每支45 yL）

陽性對照各1支（每支30 yL,共7支）

B. 羊奶粉摻牛乳成分的定性定量檢測試劑盒的組成

羊奶粉摻牛乳成分的定性定量檢測試劑盒為50次用量，由5部分組成，主要成分見表 2-7。

表 2-7 羊奶粉摻牛乳成分的定性定量檢測試劑盒的組成

Table 2-7 The composition of the qualitative and quantitative detection kit for goat milk powder

mixed with bovine components

編號包裝（50 次測試）保存方式使用方法

B1 170 yLX1 支

B2 500 yLX1 支使用時充分

B3 600 yLX1 支 -20 C

融化

牛特異性引物對（II）共 2 支(每支 45 yL)

陽性對照各1支（每支30 yL,共7支）

2.4.7.3 具體操作步驟

羊乳清粉和羊奶粉摻牛乳成分的定性定量檢測試劑盒的使用說明可參考下述具體使用操作步驟。

（1）稀釋牛特異性引物對（I）或（II）,開蓋前請先以4000 rpm離心30~60 s,慢慢打開管蓋，加入適量的TE緩沖溶液至45 yL,將各引物濃度稀釋到工作液濃度。

（2）將DNA模板、編號A1、A2、A3 （B1、B2、B3）置于冰上溶解，并輕

22 輕混勻，短暫離心以備用。

(3)反應體系配制請在冰上進行操作。為保證試驗結果，每次需設置至少一個空白對照和陽性對照。先進行初步定性檢測，取A1 (B1)試劑3.4吐，加入牛特異性引物對(I)或(II)各0.3 pL,加入1吐DNA模板，用試劑A3 (B3) 補充反應體系至10 pL,將反應混合物短暫離心并充分混合，按照以下反應條件進

行反應。

PCR反應程序：

步驟溫度時間

預變性 95 °C 5 min

變性 94 C 30 s

退火 60 C 30 s -30個循環

延伸 72 C 30 s

總延伸 72 C 10 min

( 4)反應結束后，取適量 PCR 反應液立即進行瓊脂糖凝膠電泳，確認 PCR 反應產物。

(5)若步驟(4)中初步檢測出牛乳成分，則進一步進行定量檢測。稀釋牛的 PCR 陽性對照：本產品中包含了牛乳成分分別為 0.1%， 0.5%， 1%， 5%， 10%， 30%, 50%的可直接使用的DNA片段作為陽性對照，將7種含量的陽性對照和待測樣品一起進行qPCR,每個樣品做3次重復。qPCR后得到每個陽性對照品的 qPCR Ct值，并以之為縱軸，以濃度的對數值為橫軸，繪制標準曲線。(注意：陽性對照品的配制操作一定要在獨立的區域進行，避免污染樣品或本試劑盒的其它成分。)

(6)定量試驗：取A2 (B2)試劑5 pL,加入牛特異性引物對(I)或(II ) 各0.3 pL,加入1 pL DNA模板，用試劑A3 (B3)補充反應體系至10 pL,將反應混合物短暫離心并充分混合，按照以下反應條件進行反應。

qPCR反應程序:

40 個循環

2.4.7.4結果判斷

（ 1）當空白對照無擴增條帶出現，陽性對照出現牛特異性典型條帶，同時若待檢樣品無牛特異性擴增條帶出現，可判斷該樣品檢測結果為陰性，即不含有牛乳成分。若待檢樣品出現典型的牛特異性擴增條帶，即該樣品初步定性為含有牛乳成分。

（2）若初步定性結果為非純羊乳產品，則進行下一步定量檢測。當樣本不顯示Ct值時，或Ct值必須240.0,報告為陰性；當檢測樣本CtW35.0時，報告陽性，以陽性對照品濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標準曲線，再以待測樣品的Ct值從標準曲線上推算出樣品濃度；當檢測樣本Ct值〉35.0且Ct值V 40.0時，需要再重復檢測一次，如果Ct值仍V40.0,但曲線有明顯的對數增長特性，結果為陽性，否則為陰性。

2.4.7.5 注意事項

1）使用本產品前請仔細認真閱讀產品使用手冊。

2）本產品僅供科研和乳品檢測使用，請勿用于臨床診斷及其他用途。

3）分裝試劑時務必使用新的槍頭，以防止樣品間污染。

4）試驗中需設置空白對照，按照試驗流程進行操作，避免核酸污染。

5）試劑盒中所提供的引物均為干粉狀態，使用前請先進行引物稀釋。

(6)本產品中含有熒光染料，保存本產品或配制PCR反應液時應避免強光照射。

(7)避免反復凍融本產品，反復凍融可能使產品性能下降，如果在短時間內需要頻繁使用，可在2~8 C保存。

(8)使用前請置于冰上溶解，輕輕混勻，并經短暫離心后使用。

2.5 討論

相比于其它組織和血液樣品，乳中含有的體細胞數量較少，DNA提取相對困難［100］。乳清粉在生產加工過程中會經過酸、堿、高溫高壓等，使DNA質量降低。本研究通過改進的乳清粉DNA提取方法，得到的OD260/280值為1.53~1.75, DNA 濃度范圍為122?179 ng/pL，與Liu等［101 ］對牛奶樣品試驗結果相比，OD260/280值相似，而DNA濃度范圍則高于牛奶樣品，此外，也高于Liao等［96，102，103］從奶粉或牛奶中提取的 DNA 純度。雖然 Mckillip 等［104］發現苯酚、氯仿、異戊醇法提取乳清 DNA的效率較低，但本研究中改進的方法可以去除更多的污染物和抑制劑，得到較滿意的 DNA。

摻假檢測通常要求特異性強、靈敏度高。Kang等［105］提出通過擴增多拷貝小片段DNA目標來分析加工食品樣品中的降解DNA。Villa等［106］發現使用155 bp片段的引物檢測紅花DNA的靈敏度是382 bp片段引物的1000倍。同樣的，Wang等

［107］也在一項使用傳統 PCR 方法監測高度加工食品成分的研究中發現加工食品中較短的DNA片段比較長的DNA片段更穩定。以羊乳和牛乳的DNA為模板，針對584 bp片段的牛特異性引物的靈敏度為100 ng/pL,與本研究相比較，本研究中引物Bos-Cytb的常規PCR靈敏度0.05 ng/pL較好。

從科學和實踐的角度來看，定性和定量性能至關重要，但在評估整體可行性時，還應該考慮方法的經濟方面［108］。基于 DNA 具有好的熱穩定性，本研究所采用的從乳清粉中提取DNA的改進方法以及定性定量檢測牛乳清粉的方法，能夠兼容最廣泛使用的PCR和qPCR分析平臺。相比于其它基于DNA的分析方法，在檢測時間和成本、操作復雜程度上都具有優勢。首先，DNA提取采用了改進的實驗室 DNA提取方法，在之前的研究中被評估具有成本效益［102］。其次，通常qPCR反應體系是25 pL,為了減少試劑的過度浪費以及降低檢測成本，本項目的標準反應體積被改進為10 pL,單個樣本的檢測成本至少降低一半，但是反應結果不會被改變

［108］。另外，一般來說SYBR Green和TaqMan技術作為最常用的定量方法，SYBR

Green 技術雖然只能檢測單一物種，但單個檢測成本低于 TaqMan 技術 5 倍［109］。目前乳清粉摻假檢測中不需要多物種檢測，因此，沒有必要使用 TaqMan 技術。 Velasco 在其研究中也提出 qPCR 分析成本遠低于測序的方法，使得低資源控制單元可以負擔的起［110］。PCR技術一次可用于大量樣品，相比于其它的檢測方法，這種方法更有效且不費時［111］。qPCR檢測成本由于染料或儀器的使用高于普通PCR 檢測方法，但彌補了普通PCR檢測方法不可定量分析的局限性。

從目前乳制品市場來看，羊乳本身的價格相對較高，再加之中國羊乳清粉生產具有困難和局限性。羊乳清粉的高價值不免會擾亂市場的公正交易和乳制品食用安全。鑒于以上綜合因素，采用傳統PCR和實時熒光定量PCR檢測牛乳清粉的舉措對乳制品經濟和產業發展具有重要意義。

2.6 小結

本研究改進的乳清粉DNA提取方法所提取的DNA質量較好，OD260/280值為 1.53~1.75, DNA濃度范圍為122?179 ng/yL。在牛乳清粉的定性檢測中，qPCR的靈敏度為0.01 ng/yL,高于常規PCR方法靈敏度的0.05 ng/yL.牛乳清粉含量在 0.1%?30%范圍內的定量檢測結果呈現良好的線性關系(R2=0.9858)。相對誤差隨二元混合比例的增加而減小。CV值接近或小于5%, RSD小于5%,具有良好的準確性和重復性，為羊乳產品中牛乳成分的定性、定量提供了一種準確、有效的方法。在此研究基礎上開發了羊乳產品摻牛乳成分的定性定量檢測試劑盒，該系列試劑盒在保證結果穩定、準確的前提下能夠降低檢測成本，在不同環境及條件下能夠保持良好的特異性及靈敏度，可以滿足大多數實驗室的應用，市場前景廣闊。

第三章市售羊奶粉的 DNA 質量評價及牛乳摻假檢測

3.1引言

羊乳相比較于牛乳更容易被消化和吸收，被認為是天然營養成分來源，隨著消費者對羊乳產品的質量和營養認知度不斷提高，并且近些年國家地方政策的出臺和保障，羊奶粉品牌如雨后春筍般涌現，由羊乳制造的各種產品逐漸以牛奶粉“替代品”角色進入消費市場。然而市場上存在羊奶粉產品在產品標簽中未進行注明的情況下摻入牛乳成分的情況，以次充好，且不易辨別，使得對牛乳成分過敏的人食用后存在健康安全威脅，同時也有價格欺騙的情況，阻礙了羊乳產業及市場的健康發展［112］。因此，羊奶粉的真實性或污染檢測已作為羊乳產品營養安全檢測的重點項目之一［113］。

目前應用于乳制品摻假檢測的方法種類多，常見的主要有免疫學技術、光譜技術、電泳技術、分子生物學技術等［114-117］，其中，基于DNA的摻假檢測技術是近些年在食品鑒偽中被認為較權威的方法，將成為未來應用的核心趨勢［118］。目前，與PCR相關的技術中qPCR常被用于物種鑒定，Microsatellites和NGS較常用于食品中動植物種類的鑒定， dPCR 也在肉類鑒別檢驗中應用較多［119］。考慮到羊奶粉是經過深加工的乳制品，DNA質量在產品生產過程中會受損傷，因此，如qPCR 這樣的對 DNA 質量要求不高且具有高靈敏度的檢測方法被采用［118］。基于此，本章結合普通PCR和qPCR對市售不同種類的羊奶粉進行定性和定量檢測，為食品安全監管部門對羊奶粉的標簽聲明驗證提供理論依據，同時也為消費者提供安全、質量信息的參考。

3.2試驗材料與儀器

3.2.1試驗材料

本試驗所用的國內外 38 種市售品牌的羊奶粉購買于國內線上、線下門店。其中 33 個純羊奶粉中有6個為國外品牌，其余5 個配方羊奶粉為國內品牌。所有羊奶粉樣品被編號，32個國內羊奶粉編號為1?31和38，6個國外羊奶粉編號為32?37，所有樣品均存放于常溫條件下。純羊奶粉和純牛奶粉是由生鮮羊奶和牛奶噴霧干燥獲得。

3.2.2試驗試劑

本章試驗所用試劑同表 2-1，引物信息見表 3-1。表 3-1 引物序列

Table 3-1 Sequences of the primers

引物引物序列（5'-3'）片段大小參考文獻

F: TATTAGGCCTCCCCCTTGTT

ATP6 R: CCCTGCTCATAAGGGAATAGCCC 294 bp Liao 等[96]

12SBT- F: CTAGAGGAGCCTGTTCTATAATCGATAA 346 bp L6pez-Calleja 等

REV R: AAATAGGGTTAGATGCACTGAATCCAT [120]

3.2.3儀器和設備

本章研究的主要儀器設備見表 2-3。

3.3試驗方法

3.3.1羊奶粉DNA提取方法

羊奶粉DNA提取方法同2.3.1。

3.3.2羊奶粉DNA提取濃度、純度、完整性檢測

羊奶粉DNA的濃度、純度及完整性檢測方法同2.3.2。

3.3.3羊奶粉中牛乳成分的普通PCR檢測

3.3.3.1普通PCR檢測羊奶粉中牛乳成分DNA的檢測限

為驗證普通PCR檢測牛奶粉中DNA的能力，按照0.01%、0.1%、0.5%、1%、 5%、 10%、 30%、 50%的純牛奶粉比例與純羊奶粉進行二元混合，并且按照2.3.1的方法提取DNA,通過對表3-1中牛特異性引物12SBT-REV采用普通PCR反應體系及擴增條件進行檢測，反應體系和反應條件見 2.3.3。

3.3.3.2普通PCR對市售羊奶粉的定性檢測

將38種市售羊奶粉按照2.3.1提取DNA,利用2.4.7.1中的普通PCR檢測試劑盒，采用牛特異性引物12SBT-REV進行普通PCR擴增，檢測38種市售產品中的牛源性成分。PCR反應體系及擴增條件同2.3.3。

3.3.4羊奶粉中牛奶粉的qPCR檢測

3.3.4.1qPCR檢測牛奶粉DNA的靈敏度

牛奶粉DNA按照10倍梯度連續稀釋成100 ng/pL、10 ng/pL、1 ng/pL和0.1 ng/pL, qPCR以SYBR Green I為染料，12SBT-REV為引物測定擴增效率和靈敏度。得到的Ct值作為縱坐標，與代表DNA濃度對數值的橫坐標建立標準曲線。擴增效率按照 2.3.5 中的計算公式得到。

qPCR反應體系同2.3.5。擴增條件為：經95 °C預變性10 min；再95 °C變性 30 s, 60 C ( 12SBT-REV) /58 C (ATP-6)退火 1 min,在 72 C 下延伸 1 min，該過程重復40個循環；熒光信號在每次循環結束處采集，熔解曲線溫度為65—94 C。

3.3.4.2qPCR對市售羊奶粉的定量檢測

按照 0.01%、 0.1%、 0.5%、 1%、 5%、 10%、 30%、 50%的純牛奶粉比例與純羊奶粉進行二元混合，制備定量檢測標準曲線模型。按照 2.3.1 的方法提取二元混合奶粉DNA以及38種市售羊奶粉DNA,利用2.4.7中的羊奶粉摻牛乳成分的定性定量檢測試劑盒，以表3-1中牛特異性引物12SBT-REV為目的基因，以3.3.4.1中的qPCR反應體系及擴增條件進行檢測。

3.3.5 統計分析

所有樣品重復3 次測定，結果取平均值。 SPSS 22.0統計學分析軟件被用于對數據分別進行 T 檢驗和顯著性分析。

3.4結果與分析

3.4.1羊奶粉DNA提取含量、純度、完整性結果

3.4.1.1不同種類羊奶粉DNA含量與純度的結果

使用超微量分光光度計對38種市售羊奶粉DNA純度和含量的檢測結果如圖 3-1所示。所有羊奶粉樣品DNA的OD260/280值在1.3~1.5范圍內，純羊奶粉DNA 的OD260/280值約1.4,配方羊奶粉約1.25,純羊奶粉的OD260/280值顯著高于配方羊奶粉（P<0.05）。DNA含量在200?500 ng/yL之間，其中純羊奶粉與配方羊奶粉比較，DNA含量顯著較高（P<0.05）。可見，無論是DNA純度還是含量，純羊奶粉均較高于配方羊奶粉。

圖3-1 2種羊奶粉DNA的純度(A)與含量(B)

Fig. 3-1 The DNA purity (A) and yield (B) of two kinds of goat milk powder

注：*表示2種羊奶粉之間有顯著性差異(尸<0.05)。

Note: The * indicated that there was a significant difference between the two kinds of goat milk powder

(P<0.05).

3.4.1.2羊奶粉DNA完整性結果

市售羊奶粉DNA的降解程度通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，如圖3-2所示。羊奶粉中總基因組 DNA 電泳結果顯示， DNA 存在不同程度的降解，多數泳道有彌散和拖尾的現象，說明羊奶粉DNA有明顯的降解，且DNA提取中存在有蛋白質、酚類等污染。

圖3-2 38種市售羊奶粉DNA的完整性

Fig. 3-2 The DNA integrity of 38 kinds of commercially available goat milk powder

3.4.1.3市售羊奶粉DNA的PCR擴增效果結果

由于羊奶粉DNA降解情況較明顯，為了檢驗DNA的PCR擴增能力，使用羊特異性引物ATP6擴增從羊奶粉中提取的DNA,擴增結果如圖3-3所示。38個市售羊奶粉中總基因組 DNA 都成功擴增出了 294 bp 的目標條帶，且目標條帶都清晰明亮，無非特異性條帶，空白對照沒有出現擴增。該結果證明，羊奶粉DNA雖然存在雜質和不同程度的降解，但 DNA 模板的數量和質量滿足 PCR 擴增，可用于下一步檢測分析。

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 M13 14 1516 1718 1920 21 22 23 24 25 26 27 2829 30 31 32 M 33 34 35 36 37 38NA

圖3-3 ATP6引物擴增38種市售羊奶粉DNA

Fig. 3-3 ATP6 primers used to amplify 38 kinds of commercially available goat milk powder DNA

3.4.2羊奶粉中牛乳成分的普通PCR檢測結果

3.4.2.1二元混合奶粉中牛乳成分DNA的普通PCR檢測限分析

使用牛特異性引物 12SBT-REV 擴增不同含量牛奶粉的二元混合奶粉 DNA，

擴增結果如圖3-4所示。泳道1到泳道8，代表0.01%的泳道1沒有顯示出目的條帶，泳道2 到泳道8 牛奶粉含量依次增加， 346 bp 的目標條帶逐漸變亮。該結果表明，普通PCR對牛奶粉的檢測最低可達到0.1%的檢測限。

M12345678 NTC

"—346 bp

圖3-4二元混合奶粉中牛奶粉DNA的普通PCR檢測限

Fig. 3-4 Detection limit of bovine milk powder DNA in binary mixed milk powder by conventional

PCR

注： 1-9泳道分別代表含有牛奶粉0.01%、0.1%、0.5%、1%、5%、10%、30%、50%的二元混合奶粉和無模板對照。

Note: Lanes 1-9 respectively represented binary mixed milk powder containing 0.01%, 0.1%, 0.5%, 1%, 5%, 10%, 30% and 50% of bovine milk powder and non-template control.

3.4.2.2 38種市售羊奶粉中牛乳成分DNA的普通PCR檢測結果

設置空白對照，以純羊奶粉為陰性，純牛奶粉為陽性，使用牛特異性引物 12SBT-REV 擴增 38 個市售羊奶粉 DNA 以檢測牛奶粉的存在，檢測結果如圖 3-5 所示。 38種羊奶粉中有8種含有牛奶粉，分別是2、 3、 7、 8、 12、 17、 18、 30號樣品。由表3-2羊奶粉產品配料信息發現， 7、 12、 17、 30號樣品中添加有脫鹽乳清粉或乳清蛋白粉，與PCR擴增檢測結果一致，而2、3、8和18號樣品配料中顯示僅為生羊乳，沒有說明含有牛乳成分，因此，這4種羊奶粉樣品中有牛乳成分的

污染或摻假。標明配方羊奶粉的 15 號樣品，在配料表中未發現有牛乳成分，且檢測結果也顯示不含牛乳。綜上所述， 38種市售羊奶粉中， 2、 3、 8、 18號國產羊奶

粉樣品檢測結果與配料表不相符，含有牛乳成分。

圖3-5 38種市售羊奶粉中牛奶粉DNA的定性檢測

Fig. 3-5 Qualitative detection of bovine milk powder DNA in 38 kinds of commercial available goat milk powder

3.4.3羊奶粉中牛乳成分的qPCR檢測結果

3.4.3.1 qPCR對牛乳成分DNA的靈敏度檢測結果

利用牛特異性引物12SBT-REV通過qPCR檢測二元混合奶粉中牛乳成分的擴增效率和靈敏度的結果如圖3-6所示。牛奶粉DNA濃度從100 ng/pL連續10倍稀釋至0.1 ng/pL,得到良好的線性關系(R2=0.999),斜率為-3.141，由2.3.5中的公式計算得到擴增效率為108.1%。表明12SBT-REV牛特異性引物在qPCR中具有較

log initial DNA amount (ng)

圖3-6 qPCR檢測牛奶粉DNA的靈敏度

Fig.3-6 Detection of DNA sensitivity of bovine milk powder by qPCR

3.4.3.2 qPCR對市售羊奶粉中牛乳成分的定量檢測結果

為了更好的對牛奶粉的含量進行準確定量，建立了 0.1%至 50%的定量標準曲線，如圖 3-7 所示。當牛奶粉含量在 0.1%~50%范圍之間，標準曲線的線性關系良好(R2=0.9868),表明該標準曲線可被用于牛奶粉含量的測定。

圖3-7 qPCR定量檢測牛奶粉含量的標準曲線

Fig. 3-7 Standard curve for quantitative detection of bovine milk powder content by qPCR 通過定量標準曲線對定性檢測得到的 4 種與配料不相符的羊奶粉進行更準確的牛乳成分的定量檢測，所得定量檢測結果如圖3-8和表3-2所示。標號為2、 3、 8、18號的市售羊奶粉的擴增曲線均呈現S型，熔解曲線呈現單一熔解峰(圖3- 8)。qPCR測得的Ct值分別為25.33、28.64、26.42和19.45，相應的牛乳成分為 1.70%、 0.1%、 0.66%、高于50%。表明， 2、 3、 8號羊奶粉中牛乳成分很低，而18

號羊奶粉樣品中含有較多的牛乳成分。

圖3-8含有牛奶粉樣品的qPCR擴增曲線和熔解曲線

Fig. 3-8 qPCR amplification curve and melting curve of bovine milk powder samples.

表3-2 38種市售羊奶粉中牛奶粉含量結果

Table 3-2 Results of bovine milk powder content in 38 kinds of commercially sold bovine milk powder

樣品類型樣品序號標識主成分牛引物Ct值牛DNA 判定結果摻假比例

純牛奶粉陽性對照生牛乳 18.24 +

純羊奶粉陰性對照生羊乳 31.32 -

純羊奶粉 1 生羊乳 —— - 相符

純羊奶粉 2 生羊乳 25.33 + 不符 1.70%

純羊奶粉 3 生羊乳 28.64 + 不符 0.10%

純羊奶粉 4 生羊乳 —— - 相符 -

純羊奶粉 5 生羊乳 —— - 相符

純羊奶粉 6 生羊乳 —— - 相符

配方羊奶粉 7 生羊乳乳清蛋白粉 —— + 相符

全脂羊奶粉 8 生羊乳 26.42 + 不符 0.66%

純羊奶粉 9 生羊乳 —— - 相符

純羊奶粉 10 生羊乳 —— - 相符

全脂羊奶粉 11 生羊乳 —— - 相符

配方羊奶粉 12 生羊乳脫鹽乳清粉 —— + 相符

純羊奶粉 13 生羊乳 —— - 相符

純羊奶粉 14 生羊乳 —— - 相符

配方羊奶粉 15 生羊乳添加劑 —— - 相符

全脂羊奶粉 16 生羊乳 —— - 相符

配方羊奶粉 17 生羊乳脫鹽乳清粉 —— + 相符

全脂羊奶粉 18 生羊乳 19.45 + 不符 >50%

全脂羊奶粉 19 生羊乳 —— 相符

全脂羊奶粉 20 生羊乳 —— 相符

全脂羊奶粉 21 生羊乳 —— 相符

純羊奶粉 22 生羊乳 —— 相符

純羊奶粉 23 生羊乳 —— 相符

純羊奶粉 24 生羊乳 —— 相符

純羊奶粉 25 生羊乳 —— 相符

純羊奶粉 26 生羊乳 —— 相符

純羊奶粉 27 生羊乳 —— 相符

純羊奶粉 28 生羊乳 —— 相符

純羊奶粉 29 生羊乳 —— 相符

配方羊奶粉 30 生羊乳脫鹽乳清粉 —— + 相符

純羊奶粉 31 生羊乳 —— 相符

純羊奶粉 32 生羊乳 —— 相符

純羊奶粉 33 生羊乳 —— 相符

配方羊奶粉 34 生羊乳 —— 相符

純羊奶粉 35 生羊乳 —— 相符

全脂羊奶粉 36 生羊乳 —— 相符

純羊奶粉 37 生羊乳 —— 相符

全脂羊奶粉 38 生羊乳 —— 相符

3.5討論

羊奶粉生產中多道高溫高壓加工程序會對乳中的 DNA 造成一定的破壞，使 DNA 發生不同程度的斷裂或降解，另外在 DNA 提取過程中，蛋白質、酚類物質

35 的殘留也使提取具有一定的難度，影響DNA的質量。本試驗從羊奶粉中提取得到的DNA OD260/280值雖然低于最佳值1.8［121］,只有1.3~1.5，但與Liao等［96］試驗所得DNA的純度相近。本研究得到的DNA濃度范圍為200~500 ng/吐，與Liu等［101］和劉永峰等［97］從牛乳中獲得的DNA濃度值相比均較高。高溫使細胞膜的通透性的增加可能是 DNA 濃度提高的原因，朱揚等［122］在試驗中也發現經過高溫高壓加工后的肉制品，相比較于生肉組，DNA含量顯著升高。此外，在本試驗中還發現，相比較于配方羊奶粉，純羊奶粉的DNA純度和含量顯著較高，這可能不僅因為配方羊奶粉中存在較多的添加劑及營養物質，而且兩種不同類型的羊奶粉在生產加工工藝上存在區別，這些因素干擾并影響了 DNA的提取質量。總而言之，本研究中采用的DNA提取方法得到的DNA,能較好的滿足下一步的檢測試驗。

本研究得到羊奶粉中牛乳成分的檢測限為0.1%,低于Rodrigues 等［123］以PCR 方法測得的 0.5%的牛乳檢測限，在此檢測限下檢測出有 41.2%的市場羊奶中摻有牛乳。 Liao 等［96］測得的牛奶成分的檢測限與本試驗中的檢測限結果相同，然而其認為由于 0.1%水平下的目標分析物濃度低，使該水平下的定量結果存在不可靠性。在實際生產、檢測應用中，從經濟角度考慮到 0.1%的牛乳含量所帶來的經濟利潤的可能性較小，因此，定性檢測 0.1%牛乳成分相比較于定量檢測更有意義。

38種市售國內外羊奶粉中，配料表未標有牛乳成分的羊奶粉中檢測出4種羊奶粉中含有牛乳，且均為國內羊奶粉。檢測出牛乳成分低于10%的羊奶粉有3種，據報道超過10%的牛乳摻假通常具有經濟利潤［124］，因此這3種含有牛乳成分的羊奶粉可能受污染所致。

3.6小結

本研究結合普通PCR和qPCR對羊奶粉中的牛乳成分分別進行了定性和定量檢測。提取的羊奶粉DNA的OD260/280值為1.3~1.5，含量在200~500 ng/yL之間，在DNA純度和含量方面，純羊奶粉顯著高于配方羊奶粉（PV0.05）, DNA雖然存在不同程度的降解，但其質量能夠滿足PCR擴增檢測要求。普通PCR和qPCR對牛乳檢測的最低檢測限為0.1%,在0.1%~50%牛乳含量范圍內，qPCR可實現定量檢測。 38種市售羊奶粉中發現有4種聲稱純羊奶粉的國內品牌羊奶粉檢測出牛乳成分， 3 種牛乳含量約為 1%， 1 種則高于 50%，本研究增加消費者對國內外羊奶粉質量安全情況的了解，為商品羊奶粉提供定性定量檢測的依據。

第四章羊奶粉營養安全信息管理系統的設計與構建

4.1引言

目前，根據我國食品藥品監督管理局分別設置的食品抽檢結果查詢系統、食品藥品監管數據中心和國家藥品抽驗查詢數據庫等顯示，食品監管越來越朝著數據化管理方向發展［125］。關于食品安全品質標準的大數據應該包括食品樣本檢測結果數據、結果分析以及食品安全標準信息。盡管我國各食品種類的安全標準被不斷的重塑和更新細化，但是對于具體類別食品樣本檢測結果的數據整合和分析仍需要整理。隨著羊乳產業被大力支持和發展，羊奶粉營養安全品質信息管理系統在科研院所研究、食品質檢單位監測、企業提升產品品質的過程中扮演越來越重要的角色，是數據有效整合、分析和綜合應用等方面的重要工具。為了推進羊乳產業更快更好發展，監管部門和企業迫切需要對羊奶粉信息數據實施有效管理，使其能夠為科研機構、質量監管部門、生產者和消費者等提供羊乳營養安全信息。

奶粉實際生產中的相關管理系統有奶粉倉儲管理系統、奶粉銷售管理系統、奶粉溯源管理系統等。冷友斌等［126］通過數據庫技術、色譜技術以及營養衛生學調查手段的結合運用，建立了我國母乳數據庫，在此基礎上創新了嬰幼兒配方乳粉，提高我國乳品企業的競爭力。將信息管理系統應用到乳品行業，能夠及時應對和解決羊奶粉質量中存在的問題，能夠很大程度上提升對羊奶粉品質監管的科學化管理水平，幫助企業根據羊奶粉品質數據庫的信息提高羊奶粉生產加工品質，提高企業競爭力。然而，關于羊奶粉營養安全信息方面，目前無論是食品質量監管部門還是乳制品生產企業，只是對奶山羊與生乳的質量或乳制品產品實行綜合管理，對羊奶粉的基礎營養安全數據并沒有建立專門的信息管理系統，缺乏有效的存儲、管理、分析以及較全面的監測［127］。因此，開發并建立羊奶粉營養安全信息管理系統對乳制品企業來說十分重要。

對于羊奶粉營養安全信息管理系統的開發，選取合適的架構和數據庫是一件很重要的事情。隨著Web技術的快速發展，B/S （Browser/Server,瀏覽器/服務器模式）成為常見軟件開發的架構之一，它是在前端實現極少數事務邏輯，在服務器端實現主要的事務邏輯。基于廣域網的 B/S 架構具有更強的適應范圍，僅僅通過瀏覽器就可以使用戶在不同時間和地點實現操作，極大地簡化了客戶端［128］，也正由于客戶端使用瀏覽器，從而使整體的系統開發、升級和維護等問題具有更大的便

37 利性，不僅簡化了系統，還可以讓系統整體的成本得以降低［129］。

MySQL是目前十分流行的一款關系數據庫管理系統。它是用C以及C++編寫，代碼可移植性較高，可實現在多種操作系統環境中運行［128］，不僅支持較多的計算機編程語言，而且源代碼可供任何用戶免費下載和使用，具有體積小、運行速度快、開發成本低的特點［130］。在用戶信息安全保障方面也是需要登錄用戶名稱和密碼驗證后才可登錄系統［131］。因此，對大多數中小型網站而言，MySQL不僅易于開發，而且功能強大，相對安全，占有很大市場比例。

綜上，本研究基于B/S架構及MySQL數據庫設計并建立的羊奶粉信息管理系統，該系統考慮到了國內外市售羊奶粉、自檢羊奶粉、生鮮羊奶等數據，具有增加、刪除、修改、查詢、判斷等功能，目的是為羊奶粉營養、安全品質檢測中產生的大量數據、記錄文件等提供數據源管理系統，使其在生產加工、品質監管中成為一個輔助管理工具，實現羊奶粉營養、安全品質監管相關信息的跨地域、跨行業、跨部門的信息共享。該系統有利于提升羊奶粉生產科學管理水平，促進羊奶粉產品質量提升和羊奶產業高效發展，將為我國羊奶粉營養安全的計算機輔助管理系統數據庫的建立奠定基礎。

4.2羊奶粉營養安全信息管理系統的設計開發

4.2.1系統規劃分析階段

系統規劃主要是對羊奶粉發展的環境、目標以及現有系統的狀況進行調查分析，從現實情況考慮，確保分析的合理性和科學性，使系統具備使用價值。現階段羊奶粉行業高速發展，市售的羊奶粉產品品牌和數量逐年增加，但缺乏關于羊奶粉產品營養安全信息的統計整合，并且羊奶粉產品數據信息的分析也不足。因此，羊奶粉營養安全信息的獲取和利用存在一定困難。隨著陜西省“千億級奶山羊全產業鏈”項目的推進實施，奶粉企業提升羊奶粉生產加工工藝、質檢單位監控羊奶粉營養安全、科研單位研究羊奶粉品質等以及消費者了解掌握羊奶粉產品營養安全信息等均需要通過羊奶粉營養安全指標檢測數據的整合、分析和挖掘來了解相關情況。因此，本研究將對以羊奶粉產品檢測數據整合、分析等為核心的羊奶粉營養安全信息管理系統進行開發，構建一個能穩定運行，具有較強適應性、擴展性和可移植性的系統十分必要。最終形成一個界面清晰明了、操作簡單方便，能夠滿足用戶實現查詢和對分析結果使用的羊奶粉營養安全信息管理系統，服務于羊奶粉的生

產、監督與科研。

4.2.2系統設計階段

4.2.2.1 系統結構設計

本信息管理系統的邏輯框架結構分為用戶界面層、系統功能層以及數據存儲層，如圖 4-1 所示。用戶界面層為各級用戶、管理員提供了訪問信息系統的窗口，包括用戶登錄、市售羊奶粉、自檢羊奶粉、產地判斷、DNA數據庫以及電子鼻圖譜庫、電子舌圖譜庫等窗口，在相應窗口下通過程序指令操作可完成各種功能應用。管理員不僅可進行上述操作，而且還具有對用戶權限的升級以及對數據的管理與維護的特殊權限。系統功能層是對大量不同產地、品種的羊奶粉數據經過分類整理、錄入管理系統和分析，以實現羊奶粉各指標間差異對比和多種數據功能化操作，滿足用戶對羊奶粉營養安全數據的需求。數據存儲層是通過 MySQL 關系型數據庫存儲羊奶粉不同類型檢測數據（基礎羊奶粉指標檢測數據、DNA數據庫、電子鼻和電子舌圖譜庫），可通過建立索引機制達到數據快速查詢和調取相關數據的目的。

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\ 系統用戶!；系統應用功能 •:系統管理!

圖 4-1 羊奶粉營養安全信息管理系統的主要結構設計

Fig. 4-1 Main structure design of goat milk powder nutrition and safety information management

system

4.2.2.2 系統主要功能模塊設計

羊奶粉信息管理系統是為科研機構、質量監管部門、生產者和消費者等用戶提供使用的。由于面向眾多的互聯網使用者，系統的安全性、數據的采集和管理、信

息管理系統的改進和更新則成為了信息管理系統的重要組成部分。其次，國家食品安全標準對奶粉安全品質的規定基本為靜態數據，只對奶粉安全標準列出了基本閾值，并且目前還未查到關于奶粉行業產品的營養安全品質檢測的綜合數據信息，消費者對羊奶粉在符合標準下的平均標準值以及常規水平狀態的數據值無從獲知 [125]。另外，在現有關于奶粉的數據庫中，仍然缺乏大量羊奶粉品質檢測數據的整合分享、數據分析和可視化應用。因此，用戶無法對市售羊奶粉產品優勢和不足有清楚的認知和判斷。基于以上存在的問題，根據羊奶粉信息管理系統的總體需求，系統被設計為 4 個功能模塊，分別是系統管理模塊、數據添加模塊、信息查詢模塊、專題分析模塊。

（ 1 ）系統管理模塊

系統管理模塊可實現用戶、數據和功能模塊的 3 部分管理。用戶管理是保障管理系統安全性的第一道屏障，具有不言而喻的重要性。用戶憑借用戶名和密碼登錄管理系統。用戶管理可通過對不同用戶進行角色權限設置和行為管理，分配信息系統使用管理權限，使用戶在規定的權限范圍內對數據實現瀏覽查詢、增加、刪除和修改等操作，保證系統安全的維護和正常運行。數據管理是具有該部分管理權限的用戶對所有產品的檢測結果、統計分析、圖表分析進行增、刪、改、查等操作，保證每一部分數據的安全性、準確性。功能模塊管理是具有相應管理權限的用戶對不同模塊的管理，負責信息管理系統功能模塊的完善和優化。該功能模塊保證信息管理系統在使用過程中數據不會被隨意或惡意更改和刪除，確保數據的可靠性和準確性。

（ 2）數據上傳添加模塊

具有相應管理權限的用戶根據陜西省和非陜西省（國內、國外）劃分，按照不同類型（市售羊奶粉、自檢羊奶粉、生鮮羊乳）的奶粉數據，添加上傳產品檢測數據信息、數據圖表等相關數據內容。該功能模塊實現信息管理系統數據的擴充性、數據的完整性以及分析結果的多樣性。

（ 3）快速查詢模塊

產品種類的多樣性以及檢測結果的復雜性決定了用戶對通過產品搜索條件設置以實現快速、精確查詢的需求。對于系統中不同分類的羊奶粉數據均可以通過搜索條件的設置達到快速搜索到需要的產品信息的目的，該功能模塊實現數據的精確性、擴展性搜索。

（ 4）專題分析模塊

基于不同來源的羊奶粉根據不同地區以及羊奶粉種類又分為電子鼻圖譜庫電子舌圖譜庫。此外，還有產地判斷和羊奶粉DNA數據庫等專題的數據及分析，可在不同專題區域查看相應的數據及分析結果。

4.2.3系統實施階段

該管理系統基于 B/S 結構基礎，使用 IntelliJ IDEA、 Microsoft Visual Studio， Git 開發環境進行前、后端分離開發，使用微服務架構部署。前端基于 JavaScript 語言， Vue.js 即時渲染框架進行開發，最終編譯成原生 HTML（ Hyper Text Markup Language,超文本標記語言）頁面進行部署。由于用戶可能會使用不同屏幕尺寸的設備、不同版本的瀏覽器訪問前端頁面，因此需要考慮響應式的頁面設計， Element 組件便成為一個極佳的選擇。其具備許多響應式設計的優秀組件，如表格、表單、消息框等，使用戶可以在Web頁面上擁有良好的視覺效果體驗。前端承載了與用戶交互，將用戶的操作轉換到與后端的通信的職責。后端基于Java語言和Python 語言，分為兩個服務進行開發。Java部分的開發依托Spring Boot框架，此框架分離了控制器、過濾器、數據庫訪問對象等，負責羊奶粉數據的增、刪、改、查等業務，以及用戶賬戶和權限的管理。過濾器負責與Redis內存數據庫交互，將用戶的登錄信息記錄到 Redis 非關系型數據庫中，并判斷用戶登錄狀態，攔截用戶的越權請求。數據庫訪問對象負責和MySQL數據庫的交互，將運行過程中的實體對象持久化到數據庫中。Python部分的開發依托Flask框架，負責電子鼻、電子舌等分析結果圖片的上傳和管理業務，并使用SQLAlchemy與MySQL數據庫交互，將上傳分析結果圖片的信息持久化。Web服務器使用Nginx,負責流量的轉發和負載均衡，作為一個優秀的網頁服務器，在本系統中承擔轉發前、后端流量的職責。由于本系統的服務組件較多，因此使用Docker平臺對其進行容器化部署，每一個組件都看作微服務架構中的一個微服務，并作為一個容器部署在虛擬化環境中，以便于系統的遷移和迭代升級，管理系統的部署方案如圖 4-2 所示。

圖 4-2 羊奶粉營養安全信息管理系統部署圖

Fig. 4-2 Goat milk powder nutrition and safety information management system deployment diagram

4.2.4系統測試階段

為了測試信息管理系統能否達到預期的功能目標和性能要求，分別對Web應用程序進行功能測試和壓力測試。本 Web 應用程序的特點是管理數據多元，數據操作簡便，當在高負載條件下時，響應時間會增加，但是數據的管理并未出現錯誤，仍在可控范圍內。運行功能測試時，Web界面的圖形、文字、色彩及跳轉鏈接均符合預期目標；其次，數據項的管理測試中，數據的操作正常，讀寫的沖突得到了很好的調度；最后，Web應用在滿負載狀態時，請求的無響應情況僅有0.13%。以上結果表明，該羊奶粉營養安全信息管理系統能達到預期的作用目標和要求，可以進行運行試驗。

4.3 羊奶粉營養安全信息管理系統的運行與應用

4.3.1管理系統開發及運行環境

根據迭代計劃和系統功能模塊，基于 IDEA、 Vscode 開發環境，前端使用 JS

語言，后端程序使用Java語言和Python語言，并輔以Postman、Chrome開發工具進行開發。整個系統基于 B/S 模式進行開發設計，采用 Ubuntu 18.04 服務端操作系統，Windows 10客戶端操作系統，數據庫采用MySQL,利用DBeaver數據庫管理軟件。

4.3.2管理系統的主要界面

通過在瀏覽器中輸入登錄網址進入登錄頁面，用戶憑借個人賬號和密碼可登入本系統，登錄后的系統的主界面顯示如圖 4-3 所示。系統工作主界面主要包括菜單欄、狀態欄和工作區等。菜單欄為系統的大多數功能提供功能入口，點擊之后即可顯示出菜單項。狀態欄可顯示系統操作信息，通常包括坐標、操作提示、當前鍵盤狀態等，由用戶的使用狀態而定。工作區是顯示用戶的操作窗口，用戶可以點擊

4.3.3管理系統主要功能的實現

4.3.3.1 系統注冊和登錄

通過注冊頁面，用戶可設置輸入用戶名、密碼，完成提交，即可注冊為該管理系統的普通用戶。普通用戶對于信息數據只有查閱和導出等基本操作。對有需求成為系統管理員的用戶，需要向現有管理員申請，經同意后才可升級為管理員身份。系統管理員對系統操作具有最高權限，除可以進行數據的查找使用等基本操作外，

還可以升級用戶等級，并維護用戶信息，對數據進行增添、刪除、修改，維護數據的準確性和安全性。注冊成為該系統的用戶后，通過輸入注冊信息即可登錄并開始管理系統的使用。用戶注冊登錄界面如圖 4-4 所示。

圖 4-4 羊奶粉營養安全信息管理系統的用戶注冊登錄界面

Fig. 4-4 User registration login interface of goat milk powder nutrition and safety information management system

4.3.3.2 數據添加

擁有管理員權限的用戶登錄進入主界面中，左側為功能菜單項，右側則為相應功能的樣品數據信息或分析結果展示區域。在功能菜單項中分別包含了市售羊奶粉、自檢羊奶粉和生鮮羊乳的類別。在每個類別中又包括陜西省內、陜西省外的羊奶粉數據信息，管理員用戶可對陜西省內及陜西省外的羊奶粉數據信息進行修改或刪除操作（如圖 4-5），通過點擊添加產品，可對產品信息進行編輯，如地區、品牌以及各項營養安全檢測數據。此外，在DNA數據庫和電子鼻、電子舌圖譜庫中，也可進行數據、圖片信息或分析結果的添加，實現對數據的整理完善，如圖 4-6 所示。

圖 4-5 羊奶粉營養安全信息管理系統的樣本分類信息查詢列表

圖 4-6 羊奶粉營養安全信息管理系統的電子鼻圖譜數據庫

Fig. 4-6 Electronic nose atlas database of goat milk powder nutrition safety and information

management system

4.3.3.3 快速查詢

在市售羊奶粉、自檢羊奶粉、生鮮羊乳菜單分別具有快速查詢的功能，如圖 4

7 所示。用戶可根據想要查詢的不同類別指標進行選擇輸入一個或多個搜索指標，然后輸入該檢測指標的檢測值以及波動范圍進行查詢。查詢結果可顯示該產品所

有檢測指標的結果。另外，在波動范圍內也可以搜索到檢測值相鄰近的產品數據信息，真正將搜索做到精確性、可擴展性。用戶可直接觀察到羊奶粉各種檢測數據查

詢結果并且查詢結果可導出為 Excel 文件。

圖 4-7 羊奶粉營養安全信息管理系統的樣品快速查詢

Fig. 4-7 Quick query of samples of goat milk powder nutrition and safety information management

system

4.3.3.4 專題分析

（1） DNA數據庫

DNA數據庫如圖4-8所示。所有市售羊奶粉樣品采用2.3.1中乳DNA提取方法［97, 102］進行DNA分離提取，檢測DNA提取質量信息，包括DNA純度與濃度等，向數據庫用戶提供 DNA 信息參考，同時可以通過對比從不同種類羊奶粉中提取 DNA質量的差異性，了解從羊奶粉中提取的DNA質量與存在的問題，為質量檢測部門、科研單位等利用DNA進行摻假檢測研究提供基礎參考信息。

E市售羊奶粉 DNA數據

陜西省內編號 Abs260 Abs280 260/280 操作

陜西省外 1 8.45 6 1.42 修改刪除

添加產品

2 8.82 6.05 1.45 修改刪除

市售產品快速查詢

3 6.99 5.49 1.28 改刪除

DN盛數據慘改刪除

4 12.13 9.38 1.3

添加DNA信息

5 12.78 ID 1.29 慘改刪除

DNA快速查洵

電子鼻圖譜 6 14.75 10.94 1.36 樓改刪除

電子舌圏譜 7 5.14 3.73 1.37 樓改刪除

圖 4-8 羊奶粉營養安全信息管理系統的 DNA 數據庫

Fig. 4-8 DNA database of goat milk powder nutrition and safety information management system

（2）電子鼻、電子舌圖譜庫

電子鼻、電子舌圖譜庫如圖 4-6 所示。市售羊奶粉根據種類被分為純羊奶粉和配方羊奶粉，根據產地被分為陜西不同地區（西安、咸陽、渭南等）的羊奶粉。經過電子鼻檢測得到的數據綜合分析后分別得到配方羊奶粉、純羊奶粉、陜西地區不同城市純羊奶粉的電子鼻傳感器雷達圖，此外，還列出了電子鼻傳感器對應的化合物類型表。經過電子舌檢測后進行綜合分析得到配方羊奶粉與純羊奶粉、陜西地區與非陜西地區純羊奶粉的PCA圖。同時，在各個分析圖的旁邊標有分析解釋說明，可以幫助用戶更便捷、更快的理解分析檢測結果，利用該分析結果幫助奶粉企業提升羊奶粉產品的品質。

（ 3）產地判斷通過多項指標的檢測及綜合分析，總結出陜西省與非陜西省之間多個存在差異且可作為產地判定的相關性指標（如脂蛋比、鈣磷比、反式脂肪酸與總脂肪酸的比值等）。用戶在多個相應判定指標中選擇性輸入產品檢測數據，由系統提示結果是否可能為陜西或非陜西地區的羊奶粉。例如，當輸入 2 個判定指標數據符合陜西羊奶粉數據要求，其余為非陜西羊奶粉數據時，結果顯示為“該產品可能是陜西羊奶粉”；當輸入任意3個判定指標數據符合陜西羊奶粉數據要求時，結果顯示為 “該產品極有可能為陜西羊奶粉”；當輸入任意4個判定指標數據符合陜西羊奶粉數據要求時，結果顯示為“該產品確定是陜西羊奶粉”，如圖 4-9 所示。

圖 4-9 羊奶粉營養安全信息管理系統的樣品產地判斷

Fig. 4-9 Judgment of sample origin of goat milk powder nutrition and safety information

management system

4.3.3.5 功能模塊管理

模塊管理功能僅可由系統管理員操作。由于在以后應用過程中必然存在大量數據的積累分析，挖掘、探索出新的數據關系，或者需要提供個性化功能需求，因此，可以根據實際需要或用戶需求繼續對系統進行模塊開發和優化調整，從而將增加信息管理系統功能全面性、應用靈活性以及使用便捷性。

4.4討論

羊奶粉營養安全信息管理系統的數據分別來自于奶粉生產企業、食品質檢單位以及本實驗室自購的羊奶粉。數據來源較為廣泛，并且具有真實性和可靠性。在信息管理系統的開發中通常對數據的收集、整理和綜合分析等要求全面、系統和優化，這就需要具有大量數據的積累。然而只有少部分企業的羊奶粉信息被公開且樣

48 品信息存在不完整性，從零售商處購買樣本則成為快速構建數據庫的最簡單方法［132］。但這些樣本仍然需要通過檢測才能獲取數據，并且我國關于奶粉信息化的平臺比較少，食品信息平臺間的關聯度低，因此使得數據的收集具有一定的局限性，增加了數據采集的難度［133］。Marconi等卩34］在食品成分數據庫的概述中也提出了定期加強和更新食品成分數據庫，減少缺失數據以改進分析方法結果是目前需要解決的主要問題之一。因此，為確保羊奶粉營養安全信息的全面性、真實性和有效性，產品數據的及時更新和補充是目前以及未來仍然需要加強完善的方面。

數據通過進行探究和總結規律以從中獲取有價值的信息到最終形成結論，數據分析在信息管理系統中具有重要地位。根據目前已有的食品安全信息管理系統來看，主要涉及的是流程化監管［83］以及對數據的基本保存和管理［84］。而這些指標數據缺乏綜合的整理，關于產品數據的挖掘和分析程度低。例如，食品藥品監管數據中心抽查結果查詢系統僅僅對不合格指標值進行公示，較少的數據量不但代表性不足而且整合分析程度低［125］。因此，對大量收集的產品數據深入進行多方面分析是目前乃至未來羊奶粉信息管理系統不斷更新和完善的首要任務。在現有信息管理系統數據分析不足的基礎上，羊奶粉營養安全信息管理系統則以多種大量的營養安全檢測指標數據為基礎，按照不同種類和地區進行數據整合、分析與挖掘。因此，羊奶粉營養安全信息管理系統在一定程度上實現了對數據的多方面分析，包括電子鼻、電子舌圖譜、羊奶粉產地判斷等不同形式的數據分析結果，使用戶能夠隨時共享數據，了解和掌握市售產品的特點，同時再結合消費者對產品的期待和需求，把握和預測市場動態和新趨勢，提升產品在市場中的競爭優勢；對食品監管部門來說也可以分析市場上羊奶粉營養品質安全的趨勢。同時能夠根據數據信息反應的產品市場趨勢采取監管措施，促進羊奶粉品質監控和提升［135］。

羊乳具有豐富的營養價值，為了更好地對羊奶粉營養安全品質進行數據分析，在該研究中對采集到的羊奶粉產品共檢測了包括基礎營養（蛋白質、脂肪、乳糖等）、維生素類（維生素A、維生素D、維生素E等）、礦物質類（鉀、鈣、鈉等）、氨基酸類（色氨酸、蛋氨酸、亮氨酸等）等 60 多項指標。然而，羊乳中還包括的一些具有促進大腦神經系統和學習記憶力的功能活性因子［136, 137］以及影響羊乳風味的揮發性化合物［138］的數據同樣需要檢測并補充到羊奶粉營養安全信息管理系統中，使信息管理系統更加完善和全面。檢測得到的羊奶粉產品數據中蛋白質含量大約在 24%~26%之間，脂肪含量大約在 26%~30%之間，碳水化合物含量大約在 35%~38%之間，灰分含量大約在 6%~8%之間，礦物質元素中鈣（約 9500 mg/kg）、

49 鎂（約 950 mg/kg）、鐵（約 3.5 mg/kg）、錳（小于 0.5 mg/kg）、銅（約 1.0 mg/kg）、鋅（約20 mg/kg）等元素的結果，與Park［139］對美國生產的不同山羊乳商品中成分的檢測結果基本一致，而礦物質中磷、鉀、鈉的含量則存在差異，可能是由于用于加工產品的奶源存在差異，因為羊乳的營養成分會受季節、泌乳階段、品種、飲食、個體差異和環境管理條件影響［140-143］。

4.5小結

本研究基于B/S架構和MySQL數據庫，以Java作為系統主要開發語言，采用前、后端分離技術開發，使用Docker平臺進行微服務架構部署，成功建立了羊奶粉營養安全信息管理系統，實現羊奶粉各類數據的存儲和可視化。該管理系統可以有效實現快速查看和搜索羊奶粉各類基礎檢測數據，可查看不同種類和地區羊奶粉營養安全品質的差異，可根據羊奶粉相關指標的檢測結果判斷產品的產地。目前，羊奶粉信息管理系統已完成開發并獲得授權，成功應用于畜產品質量控制工程中心。將該管理系統推廣應用，能夠為科研機構、質量監管部門、生產者和消費者等提供羊乳營養安全信息，對于羊乳產業的高質量發展具有重要價值。

第五章結論與展望

5.1 結論

針對目前羊乳及羊乳產品在 DNA 質量方面的差異性和動物性成分來源的一致性問題。本研究以羊乳產品為主要研究對象，基于DNA的分子生物學方法，建立了羊乳產品中牛乳成分的定性定量檢測方法，并開發了針對羊乳產品的摻假牛乳成分的定性定量檢測試劑盒，利用該檢測試劑盒對市售的羊奶粉產品進行了牛乳成分的定性定量檢測。此外，設計并構建了羊奶粉營養安全信息管理系統。得出結論如下：

（1）改進后的乳清粉DNA提取方法得到了良好的DNA純度及濃度。qPCR 的靈敏度高于常規PCR。牛乳清粉含量在0.1%?30%范圍內的定量檢測結果呈現良好的線性關系。牛乳清粉含量的增加使相對誤差減小，且CV值與RSD均在可接受的范圍內，以上表明牛乳清粉檢測方法準確度高、重復性好。在此條件下開發了分別針對羊乳清粉和羊奶粉摻假牛乳成分的定性定量檢測試劑盒，并對本系列羊乳產品檢測試劑盒分別從外觀、組成、使用操作、結果判斷以及注意事項進行了詳細的說明。該試劑盒操作簡單，以較低的反應體系能夠完成檢測，降低了檢測成本。

（2）對38種市售羊奶粉提取DNA,純羊奶粉的DNA純度和含量均顯著高于配方羊奶粉，DNA的部分降解不影響PCR擴增檢測。普通PCR和qPCR對牛乳檢測的最低檢測限為0.1%，qPCR可定量檢測0.1%?50%范圍內的牛乳含量。利用羊乳產品中牛乳成分定性定量檢測試劑盒檢測到 4 種國內品牌的純羊奶粉檢測出牛乳成分，僅有1 種羊奶粉中牛乳成分高于50%。

（3）基于B/S架構和MySQL數據庫，以Java作為系統主要開發語言，建立了羊奶粉營養安全信息管理系統。通過構建系統管理模塊、數據上傳添加模塊、快速查詢模塊以及專題分析模塊，不僅實現羊奶粉各類數據的存儲和可視化，而且實現快速查看和搜索羊奶粉各類基礎檢測數據，查看不同種類和地區羊奶粉營養安全品質的差異，根據羊奶粉相關指標的檢測結果可判斷產品的產地。該信息管理系統經過功能測試和壓力測試， Web 界面、數據管理操作可滿足正常運行的基本要求。羊奶粉營養安全信息管理系統的建立有利于我國羊乳營養品質的提高和羊乳產業安全化、現代化發展。

5.2 展望

在本研究中，以羊奶粉為研究對象，改進了羊乳清粉中DNA提取方法，基于此研究了羊乳清粉中牛乳清粉摻假檢測的方法，并設計、構建了羊奶粉營養安全信息管理系統。但是，建立的羊乳清粉中DNA提取方法及其試劑盒，還需要進一步開展應用；本研究建立的信息管理系統也需要大規模應用，通過應用發現問題并不斷完善和升級，同時實現數據在線分析功能等。

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