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乳化異氟醸在小型豬全身麻醉中應用 及其麻醉機理研究
發布時間：2023-03-29 16:39
1前言
1.1小型豬麻醉概況
國內外開展小型豬的全身麻醉已有十幾年的歷史，主要麻醉方式有靜脈、肌肉、腹腔和 吸入麻醉，豬常用的鎮靜藥物有：安定(Diazepam)和氟哌利多(Droperidol)，它們往往配 合鎮痛藥物應用。豬鎮痛藥物常見的有：嗎啡(Morphine)、哌替啶(Pethidinum),鎮痛藥 主要是與全身麻醉藥物配合應用，減少麻醉藥用量，起到協同麻醉作用［1］。在臨床上除非是 出于有針對性的特殊治療目的，一般很少給豬單獨應用鎮痛藥物，主要由于鎮痛藥物屬于管 制藥品，豬的全身麻醉在臨床上應用較少，只有在進行復雜和難度較大的外科手術或以豬為 實驗動物的實驗外科手術時，才采用全身麻醉，這類手術需要良好的鎮靜、鎮痛和肌肉松弛， 有時還需要意識消失，而常規的鎮靜或局部麻醉方法無法滿足這些需要應用［2］。豬常用的非 吸入麻醉劑有美托咪啶(Medetomidine )、硫噴妥鈉(Thiopental Sodium )、戊巴比妥鈉 (Pentobarbital Sodium)、氯胺酮(Ketamine)、，它們在麻醉過程根據手術需要，有時單獨使 用，有時聯合使用［3］。近些年新技術和新型設備的出現使吸入麻醉有了較快發展和廣泛的應 用，常用的吸入麻醉劑有氟烷(Halothane),甲氧氟烷(Methoxyflurane),安氟醚(Enflurane)、 異氟醚(Isoflurane),氧化亞氮(Nitrous oxide)，吸入麻醉需要藥物誘導進行氣管插管，然 后使用揮發罐和呼吸機通過插管將藥物注入肺內，吸入麻醉的安全性高，麻醉時間和深度都 可控制，基本可以滿足臨床各種手術的要求［4］。
1.1.1小型豬非吸入麻醉研究進展
國內，小型豬非吸入麻醉開展較早，其中主要以復合麻醉為主。范明普等(1994)應用 846合劑和戊巴比妥鈉聯合應用對小型豬進行全身麻醉，觀察了麻醉效果，結果表明846 和 戊巴比妥鈉聯合使用具有協同作用，小型豬產生良好的麻醉效果，麻醉時間維持40min左右， 藥物聯合使用大大減少了戊巴比妥鈉的使用量［5］。常國友等(1995)監測了中國實驗用小型 豬經硫噴妥鈉進行麻醉的效果。動物分為單獨硫噴妥鈉組與硫噴妥鈉復合麻醉組。實驗中單 純硫噴妥鈉組采用肌肉、腹腔及靜脈注射途徑；硫噴妥鈉麻醉復合組除按上述給藥途徑之外， 一組加氯胺酮，另一組加地西泮。兩組呈現了良好麻醉效果，并且呼吸、循環系統無明顯抑 制現象。以硫噴妥鈉復合麻醉組效果更突出，更適合長時程手術［6］。周忠信等(2001)對實 驗用中國小型豬實施麻醉，使用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉下進行剖腹手術，嘗試戊巴比妥鈉 在大型動物外科中的應用。通過肌注氯氨酮，同時靜脈注射戊巴比妥鈉對實驗用中國小型豬 進行腹腔麻醉，結果表明手術過程平穩，肌肉松弛效果顯著，生命體征穩定，手術后蘇醒較 快［8］。孫同柱等(2003)進行硫噴妥鈉和安定聯合應用通過腹腔、肌肉注射方法與氯胺酮和 速眠新聯合應用通過肌肉注射方法對實驗用小型豬的麻醉效果的比較，實驗表明兩種麻醉方 法均能達到良好的麻醉效果，比較之下，氯胺酮與速眠新聯合應用麻醉效果更佳［9］。吳曙光 等(2006)使用速眠新II (0.1 mL/kg)和3. 5%戊巴比妥鈉(0.3 mL/kg)復合肌肉注射，麻 醉實驗香豬，觀察誘導期、維持期、蘇醒期，監測體溫、呼吸數和心率［10］。鐘海燕等(2006) 對實驗小型豬采用氯胺酮基礎麻醉輔助芬太尼、咪唑安定后實施胃造口術、膽總管結扎術， 建立豬肝硬化模型［11］。張棟等(2008)采用戊巴比妥鈉和地西泮肌肉注射與戊巴比妥鈉靜脈 麻醉方法進行實驗小型豬的麻醉，結果表明采用戊巴比妥鈉肌肉注射誘導麻醉配合靜脈滴注 麻醉效果好，麻醉過程平穩，肌肉松弛效果顯著，生命體征穩定，手術后蘇醒快［12］。范宏剛 等(2009)開發以塞環已胺、賽拉嗪和強痛靈為藥成分的小型豬專用麻醉劑(XFM),該制 劑通過肌肉注射，通過實驗證明該制劑使用方法簡單，注藥后起效迅速，可以維持60-80 min 的外科麻醉時間，而且 XFM 對小型豬各項生理指標影響輕微，可以安全應用于小型豬臨床 麻醉［13］。王洋等(2010)進行丙泊酚復合麻醉應用于實驗豬心導管術效果的觀察。術前30 min 肌注鹽酸嗎啡5 mg，咪達唑侖0. 2 mg/kg， 10 min后進入淺睡眠。按2. 5-3. 5 mg/kg靜注丙 泊酚，然后氣管插管，進行心臟導管術［14］。顏克松等(2010)探討氯胺酮與速眠新II復合應 用對實驗小型豬的麻醉效果，將氯胺酮與速眠新II等量混合，通過肌肉注射(0.28mL/kg) 對實驗小型豬進行復合麻醉，結果表明麻醉期間肌肉松弛效果好，動物呼吸和心率平穩，無 不良反應，麻醉過程平穩，生命體征穩定［16］。宋兵等(2010)比較兩種麻醉方法在小型豬心 內直視手術中的麻醉效果，第一種方法是，誘導使用氯胺酮3 mg/kg和戊巴比妥20 mg/kg， 全麻維持用氯胺酮5 mg/kg. h、戊巴比妥8~10 mg/kg. h和哌庫溴銨0. 1 mg/kg. h；第二種方法 是，誘導使用戊巴比妥30 mg/kg，全麻維持用芬太尼15?20gg/kg.h)戊巴比妥8~10 mg/kg. h 和哌庫溴銨0. 1 mg/kg. h„結果證明：小劑量氯胺酮復合戊巴比妥麻醉起效快，對呼吸和循 環抑制輕微［17］。王喆等(2011)比較氯胺酮與硫噴妥鈉復合麻醉對小型豬的麻醉效果。結果 表明，氯胺酮與硫噴妥鈉通過肌肉復合麻醉能增強麻醉鎮痛效果，肌肉松馳良好，對呼吸和 循環系統無明顯的抑制現象，麻醉較單獨使用時間延長，效果更穩定 ［15］。
國外，近年來小型豬非吸入麻醉所應用的藥物和給藥方法與人類麻醉更為接近，一次麻 醉過程中往往需要多種藥物和多種給藥途徑，通過實驗證明了吸入麻醉具有較高的安全性， 同時也體現出了其麻醉操作的復雜性。Kaiser GM等(2003)篩選藥物長時間麻醉小型豬的 效果，麻前用藥選擇肌注阿扎哌隆(2 mg/kg)、氯胺酮(30 mg/kg)和阿托品(0.05 mg/kg)， 然后靜脈注射芬太尼(0. 005 mg/kg)和丙泊酚(2 mg/kg)，維持麻醉時靜脈注射咪達唑侖(0. 5 mg/kg)、芬太尼(0. 004 mg/kg)和丙泊酚(3 mg/kg)，結果麻醉見延長到413min±95min［18］。 Goldmann C等(1999)麻前肌注阿扎哌隆(5mg/kg)和1mg阿托品，15min后肌肉注射氯 胺酮(20mg/kg),然后靜脈注射戊巴比妥鈉(6mg/kg)，麻醉維持時，靜脈注射戊巴比妥鈉 (6mg/kg)和氯胺酮(7. 2mg/kg.h)，麻醉時間可以維持72h，麻醉劑小型豬沒有損傷［19］。
Fruhauf NR等(2004)進行小型豬肝臟切除和人工肝臟支持系統安裝的手術，麻前給藥：肌 肉注射阿托品(10mg/kg)和阿扎哌隆(10mg/kg),靜脈注射硫噴妥鈉(12. 5mg/kg)和芬太 尼(0.005mg/kg)用于靜脈插管，然后靜脈注射硫噴妥鈉(8-12mg/kg),間歇注射芬太尼 (0. 0025mg/kg)，并且每30-60min注射咪達唑侖(0.25mg/kg),結果證明此麻醉方法可以滿 足手術要求，并且平板膜生物反應器適合肝臟切除后的恢復治療，可以替代之前的肝細胞裝 備生物反應器［20］。
從國外小型豬麻醉現狀來看，小型豬非吸入性麻醉多采用肌注-靜注、靜注-靜注或全麻- 局麻等麻醉方式。在麻醉整個過程中各個環節進行注重不同藥物的選擇和配伍，這樣的確可 以降低一種麻醉方法及單一麻醉藥物所產生的毒、副作用，擴大安全范圍，增強麻醉效果。 但多種藥物配合使用和不同途徑給藥，使用起來繁瑣，作用也不穩定。相比之下國內動物麻 醉學者更注重藥物種類和操作程序的簡單化。但是從國內臨床需求的現實情況出發，經濟廉 價、使用方便、效果確實、使用范圍廣以及毒副作用低的麻醉藥物更具有臨床應用價值和推 廣價值。
1.1.2小型豬吸入麻醉研究進展
在國內，吸入麻醉在近些年來才開始在小型豬麻醉中應用，但由于吸入麻醉其設備和麻 醉劑的昂貴費用，使其應用范圍較局限。李紀平等(2005)采用吸入麻醉方法對小型豬進行 麻醉，然后進行無菌剖腹產。誘導麻醉使用氧化亞氮和氧氣(2:1)和 4.5%-5%氟烷，手術中 以濃度為0. 5%-2%的氟烷維持麻醉，麻醉過程維持1.5h,實驗表明，小型豬剖腹產手術中使 用氟烷和氧化亞氮混合吸入麻醉是安全可靠的，術中鎮靜、鎮痛、肌松效果良好，并且對新 生仔豬沒有明顯的影響［21］。丁德忠等(2007)對實驗用小型豬采用肌肉注射麻醉誘導，聯合 使用藥物氯胺酮(10mg/kg)和速眠新II (0. lmL/kg),誘導完畢進行氣管插管，采用2%異 氟醚吸入維持麻醉，同時連接監護儀，對小型豬無創SpO2和HR進行監測。結果表明：吸入 麻醉前后SpO2有顯著差異(P<0. 05)；小型豬生理指標在麻醉后15min趨向穩定，麻醉后2h， 小型豬SpO2和HR分別保持在98%和78次/min，鎮痛、鎮靜、肌肉松弛度良好［22］。王洋等 (2010)研究異氟醚吸入麻醉對小型豬麻醉的效果，觀察吸入不同濃度異氟醚巴馬小型豬的 平均動脈壓、心率及身體反射情況［23］。王凱等(2011)使用氯胺酮和乙酰丙嗪對經過阿托品 處理的豬進行麻醉誘導，然后用氟烷和 50%的氧化亞氮維持麻醉，能獲得滿意的麻醉效果。 為便于插管，必要時可經靜脈注射少量2. 5%的硫噴妥鈉［24］。
國外，吸入麻醉較早就在小型豬麻醉中應用，Piermattei DL等(1970、進行小型豬麻醉， 麻前注射氯胺酮(10mg/kg)、阿托品(0.03mg/kg)和安定(0.4mg/kg)，使用異氟醚進行 誘導麻醉，然后用1-1.7%異氟醚維持麻醉，同時靜脈注射芬太尼(8pg/kg.h)和咪達唑侖 (0.5mg/kg.h) ［25］。Becker M等(1984)應用異氟烷對Gottinger小型豬進行吸入麻醉，并且 在控制通氣情況觀察了異氟烷對血流動力學及心臟機能的影響。John F. Boylan等(1996) 為了控制人濫用可卡因，以小型豬為模型進行0. 75MAC和1.5MAC異氟醚吸入麻醉，在麻 醉過程監測可卡因對心血管、心肌新陳代謝和局部血流的毒副作用［26］。Kazutoshi等(2005) 選用小型豬作為治療呼吸功能衰竭的動物模型。通過肌肉注射氯胺酮10mg/kg和硫戊巴比妥 10mg/kg誘導麻醉，然后行氣管插管，肌注泮庫溴銨0.3 mg/kg，用氟烷(0.5 vol%、與50% 氧氣混合進行吸入麻醉，順利完成了病理模型的建立［27］。Schulz R等(2001)誘導麻醉小型 豬時，使用肌注注射氯胺酮(1g)和靜脈注射硫噴妥鈉(500mg)，插管后用1-1.5%異氟醚 進行維持［28］ Finch JG等(2004)誘導使用氯胺酮(20mg/kg)和賽拉嗪(0.4mg/kg)誘導麻 醉小型豬，然后安置喉罩，通入 1.5%氟烷，如果想延長麻醉時間需要靜脈配合注射芬太尼 ［29］o oHaga HA等（2011）用50%異氟醚誘導麻醉小型豬，然后用調整異氟醚呼吸末濃度1.6% 來維持麻醉，在麻醉過程中對MAC和腦電圖（EEG）和爆發抑制閾值（BST）進行測定［30］。 C Spadavecchia等（2012）使用50%異氟醚誘導，然后用異氟醚維持麻醉，異氟醚呼吸末濃 度在1.6%-2.8%范圍調整，在調整過程給予單次和連續刺激進行小型豬疼痛反射的測定［31］。
小型豬麻醉吸入麻醉具有麻醉效果確實，安全性高，麻醉深度可控性強，對機體生理機 能干擾小等優點。在臨床應用中具有推廣價值，雖然其要求配備呼吸麻醉機和吸入性麻醉劑， 并需要有專業的麻醉人員專門操作，但是在物質文化的不斷提高和科技的進步，這些問題都 可以迎刃而解，吸入麻醉會在動物臨床手術中會得到更加廣泛的應用和推廣。
1.2揮發性麻醉藥靜脈應用研究進展
在揮發性麻醉藥非吸入給藥方式中，最早嘗試的是通過靜脈途徑給藥，目前揮發性麻醉 劑在臨床上使用大都是純液態制劑，多年臨床實驗表明，液態揮發性麻醉藥直接靜脈注射可 以導致嚴重的組織器官損傷，并出現多種并發癥［ 31］，因其具有高發的臨床危險性，臨床應用 的可行性不大。揮發性麻醉藥物想產生靜脈麻醉的效果，需要變換液體揮發藥物的承載方式， 由于揮發性麻醉藥具有較高的脂溶性，液/氣分配系數較大的特性，麻醉學家在改變揮發性麻 醉藥用藥方式方面進行了嘗試。Salman KN等（1968）在甘油一酯、甘油二酯，油和葡萄糖 的混合液中加入甲氧氟烷，經靜脈注射用于犬、兔、猴等動物［32］。實驗結果表明，該混合制 劑在多種動物上可以產生了良好麻醉效果，重要臟器功能沒有出現明顯損傷。同年，Cascorbi HF等（1968）將該制劑用于人類志愿者，但是部分志愿者出現了注射部位紅腫和血栓性靜脈 炎等不良反應，該制劑被禁止用于臨床，相關研究也沒有繼續進行［33］。
隨著脂肪乳劑產品的開發和廣泛應用，以及其他水溶性低的靜脈麻醉藥乳劑（丙泊酚） 的成功開發，為揮發性吸入麻醉藥提供了良好的載體，也為麻醉藥靜脈乳劑的開發提供了新 的思路。目前臨床廣泛使用的靜脈用脂肪乳主要有10%、 20%和30%三種濃度。液態揮發性 吸入麻醉藥為非極性化合物，在乳滴內和甘油三脂以及卵磷脂的非極性端相似相溶，并且能 穩定溶解在乳劑中。Biber等（1982）將氟烷溶于20%脂肪乳溶液中，進行貓的靜脈麻醉， 麻醉過程中鎮痛鎮靜效果良好，并且表現出較高的安全性［34］，兩年后又進行大鼠和犬的氟烷 脂肪乳劑靜脈麻醉實驗，并且對麻醉過程中犬的血流動力學進行了深入研究。Eger RP等 （1995）將異氟醚溶入脂肪乳制劑中，制成穩定的乳化異氟醚，在大鼠靜脈麻醉實驗中應用， 大鼠麻醉效果確切，僅有少數大鼠出現注射部位皮膚潰瘍現象［35］。Musser等（1999）靜脈注 射 5%氟烷脂肪乳劑進行豬全身麻醉。結果表明，5%氟烷脂肪乳劑產生了與吸入氟烷麻醉相 同麻醉效果，但是靜脈麻醉對心血管功能產生輕微抑制。實驗中對氟烷經吸入和靜脈兩種途 徑用藥時的最低肺泡氣有效濃度進行了監測，結果表明氟烷經靜脈給藥時 MAC 值低于吸入 給藥MAC，并且有顯著差異。以上結果提示：以靜脈用脂肪乳劑作為揮發性麻醉藥的溶媒是 安全可行的，而且具有較吸入方式操作方便和節省藥物等優點。
靜脈使用揮發性麻醉藥的不良反應的出現原因可能與注射制劑中含有大量游離液態揮發 性麻醉藥相關，為了提高揮發性麻醉藥靜脈用藥的臨床安全性，需要選擇高溶解度的制劑作 為揮發性麻醉劑的溶媒［37］，國內麻醉學專家從上世紀 90 年代開始就對揮發性麻醉藥的脂肪 乳制劑進行了較深入研究，并成功開發了以 30%脂肪乳作為溶劑的穩定異氟醚注射制劑-乳化 異氟醚［38］。
隨著乳化異氟醚出現后，國內學者在多種動物上進行其應用研究，大量動物實驗表明乳 化異氟醚是一種安全的揮發性麻醉藥靜脈注射制劑［39］。馬漢祥等(2006)觀察測定 Beagie 犬靜脈注射 8%乳化異氟醚的麻醉效果，并與臨床常用的異丙酚相比較。結果顯示乳化異氟 醚組合異丙酚組的翻正反射消失的時間無差異，起效時間是一致的，而乳化異氟醚組組翻正 反射恢復時間和站立恢復時間均明顯短于異丙酚組，得出結論：乳化異氟醚靜脈注射用于犬 的麻醉安全、有效的，與異丙酚相比具有麻醉作用時間短，恢復快特點［40］。柴云飛(2007) 應用 8%乳化異氟醚進行兔硬膜外麻醉作用觀察，實驗發現8%乳化異氟醚硬膜外腔用藥可產 生完全可逆的麻醉作用，不影響動物的意識狀態，且局部組織安全性較高。同時通過大鼠尾 部局部靜脈麻醉觀察乳化異氟醚是否具有局部靜脈麻醉作用，結果證明 8%乳化異氟醚可產 生局部靜脈鎮痛和麻醉作用，其麻醉作用有效率為 80%［41］。楊靜等(2010)建立選擇性山羊 外周神經給乳化異氟醚模型，探索外周神經在異氟醚制動中的作用。結果：動脈組山羊給藥 側股靜脈最低血液有效分壓約為頸靜脈的7 倍，約為靜脈組山羊頸靜脈4 倍。動脈組頸靜脈 最低血液有效分壓約為靜脈組的0.6 倍。結論：成功建立選擇性山羊外周神經給乳化異氟醚 模型，并提示高分壓異氟醚具有外周神經阻滯作用［42］。段志祥等(2012)觀察腹腔注射異氟 醚、乳化異氟醚對小鼠肌肉松弛的作用［43］。實驗中設計乳化異氟醚分為三個劑量組(0.1875、 0. 375、0. 75ml/100g)，各組均以腹腔注射給藥。用藥前及用藥后第3, 5, 10, 30, 60和90min 分別測定小鼠抓力。結果，與對照組相比，異氟醚隨著乳化異氟醚劑量加大，小鼠抓力減弱 明顯。肌松作用分別在 3min 和 5min 起效，在 10min 和 15min 達到最強，在 90min 時抓力 基本恢復正常，實驗證明腹腔注射乳化異氟醚可使小鼠產生肌松作用，且具有明顯劑量依賴 性。
同時相關研究表明，乳化異氟醚麻醉對動物心肌具有保護作用。張雷等(2009)觀察乳 化異氟醚后處理對兔在體心肌缺血/再灌注損傷的影響，并探討線粒體 ATP 敏感性鉀通道在 其中的作用。結果表明，乳化異氟醚可減輕兔在體心肌缺血/再灌注損傷，這種心肌保護作用 可能與線粒體KATP通道的激活有關［46］。邱燕等(2010)觀察含乳化異氟醚的心臟停跳液對 體外循環中犬的心肌缺血再灌注損傷的影響及其機制，結果顯示含乳化異氟醚及脂肪乳的 St.Thomas 停跳液能明顯改善缺血心臟的能量代謝，對心肌線粒體有較好的保護作用，從而 減輕心肌缺血再灌注損傷，且乳化異氟醚較脂肪乳的保護作用更強［47］。
乳化異氟醚是一種安全的，合適靜脈給藥的揮發性麻醉藥制劑，揮發性麻醉藥產生麻醉 作用的機制目前還在探索中，揮發性麻醉藥在臨床濃度下對外周神經功能影響甚微，但是高 濃度的揮發性麻醉藥常常使外周神經的動作電位降低，抑制了其傳導功能分子學機制，局麻 藥產生麻醉作用，關鍵是通過阻斷Na+通道而完成的，最近研究發現，揮發性麻醉藥對機體 內組織細胞Na+通道產生抑制作用，是產生全身麻醉作用的重要機制之一［48］o因此，乳化異 氟醚局部用藥后也可能是通過阻斷外周神經膜上的Na+通道而產生局部麻醉作用的，然而乳 化異氟醚產生局部麻醉作用可能不僅僅是通過單一機制實現，而是多種機制綜合作用的結果。 大量的研究表明，除了上述Na+通道以外，揮發性麻醉藥還可作用于體內多種受體和離子通 道，而發揮其全麻抗傷害和制動作用［49］，如N甲基天冬氨酸受體、氨基丁酸受體、谷氨酸受 體、甘氨酸受體、Ca2+、K+通道通道等。
乳化揮發性吸入麻醉藥不僅為吸入麻醉藥提供了新的劑型，也為吸入麻醉藥的藥動學提 供了新的思維，具有良好的應用前景，以乳化異氟醚最有研究和開發價值。既然乳化制劑可 以使動物產生全身麻醉的效果，那么以脂肪乳為載體的吸入麻醉劑靜脈注射與吸入麻醉劑經 呼吸道給藥途徑所產生的麻醉機理是否相同？靜脈給藥方式為什么可以減少麻醉劑的使用 量？這些問題需要進一步的實驗研究才能解釋清楚。
1.3全身麻醉機理研究進展
麻醉藥物已出現幾百多年，在過去的幾個世紀的時間里，給病人患者減輕了極大地痛苦， 為臨床外科手術技術的進步奠定了基礎，但是麻醉藥的麻醉作用的分子機制仍然沒有一個明 確的解釋，其發揮麻醉效果的藥理學之謎一直未解開，但是廣大麻醉科學家和臨床醫生為解 開麻醉劑的麻醉機理付出了艱辛專研和嘗試，雖然沒有徹底將麻醉作用機制解釋清楚，但是 對藥物結構，作用部位和位點，可能作用途徑等方面取得了一些突破，這些科學家在不同的 歷史階段也曾提出了不同的解釋這一問題的假說與理論觀點，有些被新理論推翻，有些新的 理論不能解釋所有麻醉現象，總之，現代人的每一次新的嘗試都是向解開麻醉藥物麻醉機理 靠近一步。
1.3.1脂質學說
脂質學說是全麻理論的經典學說，早在本世紀初便形成了著名的 Meyer-Overton 法則， 這一規則的提出影響了關于麻醉機制的兩種思維方法［50］。第一，由于各種結構不相關的化合 物遵守梅－歐規則，那么就可以推斷出所有的麻醉藥有可能作用在相同的分子位點。第二， 既然特定溶劑中的溶解度與麻醉效能密切相關，那么麻醉溶解度和效能之間具有最大的相關 的溶劑就可能最大程度地模擬中樞神經系統中麻醉靶位點的化學和物理特性［51］。根據以上的 推論，可以猜測麻醉作用的靶位點基本上是疏水特性的。在經過臨床麻醉學家的實驗，取得 了一些重要的依據，實驗中發現吸入性麻醉藥均是高脂溶性的藥物，而且脂溶性的大小與全 麻藥物的麻醉效能有密切關系，其后大量的試驗和臨床實踐也進一步證明，吸入麻醉藥的 MAC值和巴比妥類、醇類的ED50值與它們的脂溶性之間的關系極為密切［52］o異氟醚、安氟 醚、地氟醚等吸入性麻醉劑的旋光異構體對受體、通道有不同程度的影響，但麻醉效能無明 顯差異等研究結果也間接支持著脂質學說 ［54］。
按照梅-歐規則，麻醉藥物的效能應該與其脂溶性密切相關［55］，而事實上，一些多鹵化合 物（如氟乙烯）結構上與吸入麻醉藥類似，非但無全身麻醉作用，反而出現了致驚厥效應［56］； 某些脂溶性化合物麻醉效能伴隨著鏈長度的增長而增大。但是，超過關鍵鏈之外，即使在更 高的濃度，化合物也不能產生麻醉作用。［57］例如，在一系列的長鏈烷醇中，麻醉效能從甲醇 到正十二烷增強，所有延長的烷醇不能產生麻醉作用，這種現象稱之為截止效應；有些全麻 藥的旋光異構體即使其脂溶性相同，但卻無相似的麻醉效能［58］。用動物實驗證實［59］，巴比妥 類麻醉藥、氯胺酮、神經類固醇、依托咪酯和異氟醚的麻醉效能，都存在著旋光異構體的差 異。這些效能大小的差異范圍從依托咪酯對映體之間或神經類固醇對映體之間的 10多倍差異 到異氟醚對映體之間的 60%差異；更重要的是，脂質理論最簡單的說法也不能解釋膜上存在 的麻醉藥如何被轉換成影響包埋蛋白質功能的［60］。
隨著麻醉藥作用機制研究的不斷深入，脂質學說不能解釋一些麻醉內在問題。后來， Mullins 認為，全麻作用強度與麻醉藥物的摩爾容積有關，當全麻藥分子進入作用部位，填充 了膜脂質中孔隙的自由容積而導致全身麻醉［61］。但根據此學說測定的多種全麻藥與其摩爾容 積之間的關系仍有一定誤差，也不能解釋為何可產生麻醉。后經修改補充為臨界容積學說， 認為當藥物進入作用部位后，使疏水區容積膨脹，當此種膨脹超出一定臨界值時，可阻塞離 子通道或改變神經元的電特性而產生麻醉效應［62］。研究結果證明，脂質學說所預計溫度的降 低會抵消全麻藥物引起的膜膨脹［63-64］，不同全麻藥之間高壓逆轉全麻程度不同，且每種全麻 藥的逆轉壓與麻醉效能之間沒有呈線性改變［65］；因此有些學者就提出了多部位膨脹學說，對 臨界容積學說進一步進行論證，作用部位是多元化的。全麻藥分子有多個疏水性作用部位， 逆轉全麻作用的高壓與全麻藥物的作用部位也有不同［66］，全麻藥物各個作用部位具有不同的 限定容積，而另一些作用部位的容積是限定的，并存在于某些特異性膜蛋白上面，因此具有 受體的一些特征。由此猜測，限定容積的作用可能是臨床中各種全麻藥具有不同生理效應的 重要機理［67］。
目前普遍認為，“膜膨脹”并不是產生全麻作用的唯一因素。多部位膨脹假說在細節上雖 有待于進一步考證，但某些推測已在微觀分子水平中得到證實 ［68］。脂質學說也在進行自我完 善，這些學說的提出也能在一定程度上解釋原脂質學說難以解釋的問題，但仍未能完全解釋 全麻機制［69］。因此，迫使之后的學者們從蛋白質角度去解釋全麻藥的作用機制。
1.3.2突觸學說
Richards CD等(1983、根據以往的研究結果，提出了全麻機理的突觸學說。該學說認為， 全麻作用的產生是麻醉藥物對突觸前、突觸后綜合作用的結果 ［71］。又有研究表明：吸入全麻 藥具有抑制興奮性突觸及增強抑制性突觸的傳遞作用，而這些作用是通過膜蛋白—離子通道 實現的［72-73］o Krnlevic K等(1986)通過試驗證實全麻藥物對外周軸突沒有影響，從而推測 其可能作用于中樞的突觸傳遞［70］。因此，研究全麻藥對各類通道蛋白的作用是闡明全麻機制 的重要環節。由于膜蛋白不僅提取困難，而且提取的膜蛋白須再與脂質組合才能測定其離子 轉運功能。因此，以此種含脂質的膜蛋白模型作研究，仍然難以確定全麻藥物的作用部位和 方式，即難以確定全麻藥是直接與膜蛋白發生作用還是作用于周圍的脂質間接影響膜蛋白的 功能而產生作用。即便如此，探索全麻藥對通道蛋白的作用無疑為全麻機制的闡明提供重要 線索。因此，全麻機制研究在受體和離子通道水平進行了大量的觀測。
1.3.2.1突觸受體與麻醉
離子通道是鑲嵌在細胞膜脂質中的跨膜蛋白，由4~5個亞基圍繞而成，中間是一貫穿細 胞內外的孔道。當通道開放時，可允許某些離子通過而產生電興奮。根據通道開啟時是否需 要特殊激動劑激活將離子通道分為配體門控和電壓門控兩類［74］。肌型和神經型乙酰膽堿受 體、甘氨酸受體、GABAa受體、5-羥色胺受體及離子型谷氨酸受體等同屬于配體門控通道家 族，其共同特征均為5聚體（亞基）結構，每一亞基有4個跨膜的疏水片段（Mi?MJ；而 Na+，K+和Ca2+等電壓門控通道由4個高度同源的亞基組成（1?IV）,每一亞基又含有6個跨 膜片段（S1?S6）。因此，離子通道的基本功能是產生生物電，并通過完成對某些離子的運輸 維持細胞體積和內環境穩定。目前研究表明幾乎所用的全麻藥物都或多或少地與離子通道有 關聯［76-78］。
（1） 谷氨酸受體通道（NMDAR）
根據谷氨酸受體對多種激動劑存在不同的敏感性，至少可分為三種亞型，如 NMDA（N- 甲基-D-門冬氨酸），KA （紅藻氨酸，Kainate）及AMPA （a-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑） 受體亞型。其中 NMDA 亞型對氟烷最為敏感，并認為與全身麻醉和脊髓鎮痛機制有密切關 系［79］o研究發現，吸入全麻藥在NMDA受體通道上有其特異的結合位點。氯胺酮可在NMDA 通道孔內的位點結合產生通道阻滯和分離麻醉。NMDA受體拮抗劑dizocilpine、D-CPPene 或CGSl9755，可減低異氟醚MAC 33%~54%；聯合應用NMDA和AM-PA受體拮抗劑 （CGSl9755和MBQX）時，可使氟烷的MAC減少80%。全麻藥與NMDA系統有著多種間 接或直接的作用［80-81］。臨床劑量的苯二氮卓類、依托咪酯對 NMDA 的作用較小，但可以和 NMDA受體拮抗劑氯胺酮發揮協同作用，減少氯胺酮的不良反應［82］o
（2） 煙堿乙酰膽堿受體通道（nAchR）
乙酰膽堿受體分為毒蕈堿型受體（M受體）和煙堿型受體（N受體-離子通道型受體）。 N型受體又分為神經型和肌型兩種亞型［83］。許多全麻藥可與通道內氨基酸殘基結合發生通道 阻滯作用，從而減低nAchR對激動劑的敏感性。吸入全麻藥還可使nAchR與激動劑呈高親 和力結合，使通道處于持續失活的關閉狀態，研究還表明，神經型nAchR比肌型nAchR對 吸入全麻藥物更加敏感 ［84］。吳安石等（2005）通過不同濃度異氟醚對大鼠進行麻醉，在麻醉 過程中檢測nAchR神經遞質受體進行檢測，結果發現大鼠在不同濃度的異氟醚麻醉下，大腦 中海馬區 nAchR 的濃度隨異氟醚濃度升高而降低，具有很強的劑量依賴性［85］；張勤功等 （2005）觀察麻醉后不同時間普魯卡因滴速、血漿普魯卡因濃度、血漿 Ach 活性及 Ach 活 性降低率的變化，結果發現：普魯卡因可使Ach的釋放受到抑制，麻醉時突觸的膽堿能釋放 功能受到抑制，麻醉蘇醒時恢復正常［86］。
（3） Y氨基丁酸受體通道（GABAR）
GABA受體存在多種亞型，其中CABAa亞型與全身麻醉關系最為密切。多種吸入和靜 脈全麻藥通過以不完全相同的方式作用于 GABAA 受體，使鼠腦新皮質神經元的自發動作電 位受到抑制［87］。現知GABAa受體介導的是C1-電流，導致突觸后超極化抑制。氟烷、恩氟烷 及異氟醚等吸入全麻藥都可延長及增強GABA的觸發的超極化作用。吸入全麻藥對GABAa 受體的作用存在立體選擇性，正構體異氟醚在整體動物的麻醉作用為其反構體的兩倍，并在 鼠海馬神經元中證實，此種增強作用是由于延長了 GABAA 受體介導的抑制性突觸后電流所 致。ED50濃度全麻藥一般可增強低濃度GABA的誘發電流50%以上［88］。
(4)甘氨酸受體通道(GlyR)
目前認為，全麻藥主要通過抑制興奮性突觸傳遞和P或增強抑制性突觸傳遞來發揮其麻 醉作用，而GABA能及Gly能突觸是中樞神經系統內主要的抑制性氨基酸能突觸。在體及離 體實驗均證實Gly受體與全麻藥的作用有一定關系［89］o Dong等(2004)通過全細胞膜片鉗 檢測大鼠脊髓背角神經元的電活動，結果顯示：異丙酚可誘導產生對荷包牡丹堿和士的寧敏 感的Cl-流。小劑量異丙酚可增強GABA和Gly產生的Cl-流，在大劑量時則抑制GABA和 Gly產生的Cl-電流，表明：小劑量異丙酚可增強脊髓GABAA受體和Gly受體的作用［90］。 Quinlan等(2005)研究Gly及其受體與全麻藥的關系，實驗中使用Gly能突觸減少的突變型 小鼠進行相關檢測，結果顯示：異氟醚和安氟醚實驗組，突變型小鼠翻正反射消失的半數效 應濃度大于野生型；突變和野生型小鼠在氟烷組MAC值之間無差異；突變型的乙醚麻醉睡 眠時間大于野生型。該實驗表明Gly能突觸傳遞參與了多種吸入全麻藥的麻醉過程，且作用 機制較復雜［91］o
1.3.2.2電壓門控離子通道
電壓門控通道，包括：Na+，K+, Ca2+，Mg2+、C1-通道等。電壓門控通道主要選擇性允 許Na+，K+, Ca2+，Mg2+、C1-跨膜通過，當麻醉藥物使跨膜電位發生變化時，電敏感器在電 場力的作用下產生位移，響應膜電位的變化，造成閘門的開啟或關閉，相應的離子轉入和轉 出［92］。
(1)門控電壓Na+通道 電壓門控通道主要選擇性允許鈉跨膜通過，其開放受電壓控制，主要功能是維持細胞膜
的興奮性及其傳導，它包括九種a亞單位蛋白，每種a亞單位至少有20個外顯子所編碼。 所有Na通道a亞單位包括四個同源域，形成電壓門控性鈉選擇性親水孔隙，組成跨膜和胞 外域的氨基酸序列的相同性超過75%［93］o神經元的興奮性相當程度上依賴于鈉通道的運輸， 分布和密度，以及通道本身激活閾值和重激活特征的內在特性，因此麻醉學家對鈉通道在疼 痛通路特別是外周感覺神經元中的作用感興趣。雖然在表達的Na+通道模型上，臨床濃度吸 入全麻藥能對Na+電流產生抑制；大多數全麻藥也可使Na+通道去極化穩態活動曲線和超極 化穩態失活曲線移位［94］o Ouyang等(2003)利用膜片鉗電生理技術研究了全身麻醉藥異氟 醚和異丙酚對大鼠分離的腦垂體神經末梢部電壓門控性鈉通道的影響，發現異氟醚和異丙酚 都可逆地、劑量依賴性地抑制該部位電壓門控性鈉通道的鈉電流。由此推論鈉通道在異丙酚 麻醉中起到一定的作用［95］o
(2)門控電壓K+通道
近期研究認為，K+通道可能是全麻藥作用的靶位之一［96］,因為氟烷、恩氟烷和異氟醚都 對此通道閘門有調介作用。另外，1%?4%氟烷可減弱甚至阻斷鼠大腦神經元的K+通道電流， 如將K+通道從細胞漿面的C-末端截去318個氨基酸，氟烷阻滯此種通道的K+電流的能力則 很弱［97］。Shin等（2003）研究氟烷、異氟醚和七氟醚對大鼠小腦顆粒層神經元細胞非失活態 K+通道的影響［98］，。試驗中利用全細胞膜片鉗技術，結果發現處于非失活狀態的通道對電壓 不敏感，臨床相關濃度的氟烷、異氟醚、七氟醚能使外向整流型鉀通道電流增強，結果證明， 非失活態的鉀通道是吸入全麻藥作用的主要靶位之一 ［99］。
由于各種類型的麻醉藥對Na+、，K+通道都有不同程度的抑制作用，所以，Na+、，K+通道 可能是麻醉藥的作用靶位。這些分子水平的相互作用以及與麻醉藥作用的關系及相關性有待 于進一步的研究。
（3）門控電壓Ca2+通道
門控電壓Ca2+通道（VGCC）有6種亞型，分別為L、N、T、P、R和Q亞型［100］。T和 L型通道廣泛分布在興奮性和非興奮性細胞上，而其他各亞型主要分布在神經組織中。尤其 N和P型主要影響中樞神經系統突觸前神經遞質的釋放。
Takei等（2003）研究R型Ca2+通道缺失小鼠對異丙酚和氟烷的敏感性，結果顯示，基 因缺失小鼠對異丙酚的敏感度顯著地降低，從而表明R型Ca2+通道是異丙酚全麻作用的主要 靶位之一［101］。神經元的興奮性在一定程度上是由多機制調控的鈣信使決定的［102］。神經系統 鈣通道的狀態直接影響到胞內鈣穩態，胞內Ca2+是神經傳導中重要的信使因子。鈣通道的激 活可使突觸前水平鈣離子的胞內流動，而胞內Ca2+的變化又是神經遞質釋放的主要影響因素 ［103］。近年來許多學者相繼開展了全麻作用與鈣通道相互關系的研究。然而全麻藥對中樞神經 系統神經元細胞膜VGCC的影響仍有不同觀點，需要確鑿的深入研究結果進行判定。
1.3.3蛋白質學說
二十世紀80年代后期，隨著神經生理學、神經藥理學研究方法的廣泛應用，分子生物學 及膜片鉗技術促使了蛋白學說的形成，研究者們發現，全麻藥物是與中樞神經系統中少數的 作用靶位結合而發揮作用，而這種作用比以往認為的作用更具有選擇性，并又進一步證實這 些靶位主要是配體門控型離子通道［104］。全麻藥的作用部位是蛋白質，逐步形成并提出了全麻 藥作用機制的蛋白質學說。受體或通道亞基或肽鏈成分的改變也可影響全麻藥的作用。深入 的研究促使了蛋白質學說的形成，近幾年年來，全麻原理在細胞、亞細胞和分子水平上取得 了大量研究成果，大家逐漸認同全麻藥物是與細胞膜上受體及通道蛋白結合發生相互作用而 產生麻醉作用的［105］。許多專家已經認可全麻藥的作用部位是蛋白質，而不是脂質，確切的位 點可能是神經突觸受體、離子通道或其他調控系統，其中影響突觸的電化學傳遞可能是產生 全麻作用的關鍵［106-108］。
蛋白質學說的主要觀點認為，麻醉藥物直接與蛋白質的相互作用而產生麻醉作用，不但 滿足MeyerOverton規則，而且為不符合此規則的化合物提供了解釋。任何蛋白質結合位點都 可用像大小、形狀及其溶解特性來詳細說明。大小和形狀的限制降低了截斷之外化合物的結 合力，因此解釋了它們為什么缺乏麻醉效應［109］。不同的化合物結合到同一位點上可以對蛋白 質的構型產生不同作用。全麻藥物不僅可以改變可溶性蛋白的三級結構，而且其改變的程度 與全麻藥的脂溶性和效能相關[110]o同時研究發現多種麻醉藥物均能改變nAcHR通道、NMDA 受體通道、GABA通道蛋白的三維結構，從而導致通道的抑制和開放而產生麻醉作用。具有 相似脂溶的同分異構體，麻醉效能也不同，通過肽鏈改造和亞基重組的方法進證實通道蛋白 上的氨基酸和亞基發生改變后，全麻藥的作用可出現顯著變化，更加支持了蛋白學說的觀點
[111]o
蛋白質學說得到越來越多分子生物學研究結果的支持，但仍有部分麻醉藥的機理的解釋 存在疑問[112]；在整體動物中，兩種異氟醚的光異構體的MAC測定值并無實質性意義等。 對通道的研究也顯示，全麻藥也可能作用于疏水部位影響通道的功能等。蛋白學說目前仍未 形成完整的理論系統，不能對全麻機制研究中的某些問題作出清晰解釋 [113]o
1.3.4基因學說
隨著麻醉機理研究的深入，使麻醉機理進入基因作用時代[114]o基因是化學分子是支配生 命活動的指令，是構建生物體的藍圖。所有生命活動都直接或間接的受基因的控制，綜合目 前麻醉學基因研究方面的進展，基因學說的深入的研究有助于揭示全麻的機理。
(1)全麻藥物的生物學效應與基因的關系
在全麻藥誘導后迅速出現c-fos和c-jun基因的表達，說明基因同樣對全麻藥存在積極的 反應[115]o Rahat等(2002)實驗證實全麻藥可以導致大鼠多個器官內TNFa基因高濃度表達 [116]o Kotani 等(2005)研究證明異丙酚和異氟醚能夠引起人肺泡巨噬細胞前炎癥性細胞因 子基因出現顯著性表達[117]o Harbuzy通過嗎啡麻醉老鼠，停止輸注嗎啡后，編碼卵磷脂和促 腎上腺皮質激素基因的表達發生了顯著性變化，目前的研究已經表明全麻藥物能引起中樞神 經腦細胞許多基因表達發生變化，以上研究說明全麻藥的作用點不光局限于脂質雙層膜和通 道蛋白上，其重要的生物學和麻醉學效應與基因表達有密切的關系。
(2)基因研究方法的進展
克隆出與全麻密切相關且具有顯著特異性的基因是目前全麻機理之基因領域面臨的主 要任務，但目前沒有麻醉相關的基因克隆報道，當今分子生物學檢測技術已經比較完善和全 面，目前遇到的主要問題包括：選擇遺傳穩定的動物研究模型，目前主要以果蠅、小鼠、大 鼠為研究模型；選擇合適的麻醉中樞區域作用點；選擇尋找差異基因的檢測方法，目前較常 用代表性差異分析(RDA)技術和抑制性消減雜交(SS)技術，已經有應用相應方法發現新 基因的文獻報道，將找出的mRNA片段進行測序，然后在genebank數據庫中作同源性分析， 如果檢測出的基因是已知基因，可以進一步確認該基因在全麻機理中的作用；如果是未知的 序列，可以用快速擴增cDNA末端技術來擴增該序列，并進行對比和功能鑒定，從而可以發 現與麻醉密切相關的未知基因[124]o
(3)全身麻醉與基因克隆
基因學說的關鍵是克隆出與全麻密切相關的基因，DNA序列是生物信息最基本的表達形 式。機體的生物學功能、器質性、功能性疾病都與基因有著密切關聯[120]o目前最先進的藥物 設計和監測儀器多建立在基因組學的基礎之上，上個世紀末研究人員發現了全麻狀態與 GABAA 受體和編碼該受體的基因有密切關系［118］。金傳剛等測定果蠅吸入麻醉藥半數麻醉有 效濃度法，實驗證明果蠅對七氟醚敏感基因存在于第二對染色體上，發現果蠅對吸入麻醉藥 的敏感性由基因控制并且可以呈顯性遺傳，且遺傳非常穩定 ［119］。葉其泉等(2000)培養出 對七氟醚敏感的品系和耐藥的品系果蠅，這些基因的表達情況與全麻狀態密切相關，證明了 目前未知的全麻特異性的基因群的存在。在對藥物成癮機理的研究中，經嗎啡處理后的大鼠 腦中樞多個核團出現的新的mRNA片段，其中部分確定是已知基因，功能與文獻中基本一致， 有些是未知序列，正在進行這些基因研究，相應基因功能也在檢測中，進一步證實了麻醉與 基因調控的密切聯系［128］。近年來對未知基因進行克隆和功能鑒定是基因學科發展的主要研究 工作之一。然而對于麻醉學科，尤其對于復雜的麻醉機理的解釋需要轉向基因學說方向，因 此克隆出于全麻密切相關的基因群是進一步探討全麻機理的關鍵。
綜上所述，基因學說正逐漸成為全麻機理中的研究熱點，其研究結果有助于揭示復雜的 全麻機理。
1.4全身麻醉與中樞信號轉導系統
1.4.1全身麻醉與ATP酶跨膜信號轉導系統
Na+-K+-ATP 酶和 Ca2+， Mg2+-ATP 酶分布于各類細胞質膜中，不同的組織中活性差異較 大，尤以興奮性和分泌性組織中活性最高。在神經和肌肉細胞的沖動傳導等方面起著重要作 用。Ca2+，Mg2+-ATP酶也是細胞膜上重要的酶，其維持細胞內Ca2+和Mg2+濃度穩定，在神 經細胞動作電位的傳導、心肌及其它肌肉的收縮、細胞的分泌和繁殖均有重要影響。麻醉藥 對Na+-K+-ATP酶、Ca2+，Mg2+-ATP酶活性有抑制作用，從而改變細胞膜內外Na+，K+、Ca2+， Mg2+穩態，影響突觸興奮、突觸傳遞和突觸的遞質釋放而產生麻醉作用［125］o
先前研究表明：靜脈全麻藥產生麻醉作用是因為麻醉藥物對 Na+-K+-ATP 酶活性的抑制 作用產生的。Ratnakumari等(1997)給大鼠腹腔分別注射異丙酚和氯胺酮，采集不同腦區組 織來檢測 Na+-K+-ATP 酶的活性，結果表明，異丙酚和氯胺酮能明顯抑制大鼠大腦、海馬和 腦干突觸體Na+-K+-ATP酶的活性，離體的大鼠大腦皮質突觸體經過25、100^mol異丙酚處 理，Na+-K+-ATP酶的活性沒有發生變化［129］o王鈞等(1998)檢測丙泊酚麻醉后大鼠腦突觸 體 Na+-K+-ATP 酶和 Ca2+，Mg2+-ATP 酶活性，腹腔注射丙泊酚，大鼠大腦皮質、海馬、腦干 突觸體Na+-K+-ATP酶和Ca2+，Mg2+-ATP酶活性酶活性顯著下降，且大鼠行為學變化與藥物 劑量呈現依賴性，表明丙泊酚產生的全麻作用與上述腦區突觸體 Na+-K+-ATP 酶和 Ca2+， Mg2+-ATP 酶活性受到抑制相關［128］。胡興國等(2000)通過不同劑量異丙酚麻醉大鼠，在麻 醉過程中對大鼠腦突觸體 Na+-K+-ATP 酶活性進行檢測。結果表明：腹腔注射低劑量的異丙 酚能明顯地抑制海馬和腦干突觸體Na+-K+-ATP酶的活性，而對大腦皮層突觸體Na+，K+-ATP 酶的活性無明顯影響；高劑量氯胺酮能明顯抑制大腦、腦干、海馬突觸體 Na+-K+-ATP 酶活 性，且高劑量注射時大腦、腦干、海馬 Na+-K+-ATP 酶的活性顯著低于低劑量大腦、腦干、 海馬Na+-K+-ATP酶的活性。表明異丙酚通過抑制腦突觸體Na+-K+-ATP酶的活性而產生麻醉 作用[127]o張志龍等(2001)在氯胺酮麻醉大鼠過程中對大腦皮層和丘腦突觸體Na+-K+-ATP 酶活性進行了檢測，結果發現大鼠在腹腔注射氯胺酮后，大腦皮層和丘腦 Na+-K+-ATP 酶活 性明顯降低，直到翻正反射恢復和完全蘇醒后 Na+-K+-ATP 酶活性才恢復正常水平，表明 Na+-K+-ATP酶在氯胺酮全麻中具有重要調節作用[126]o Dai Ishiwa等(2004)檢測異氟醚和氯 胺酮對中腦黑質致密部K+-ATP酶活性變化，結果證明3%異氟醚可以抑制K+-ATP活性，氯 胺酮可以細胞內K+-ATP出現劑量依賴性降低，實驗證實異氟醚和氯胺酮可以抑制K+-ATP酶 活性[130]o
1.4.1.1全身麻醉對Na+-K+-ATP酶的影響
Levitt 等(1975)分離出大鼠的大腦皮質突觸體，利用不同濃度的氟烷和安氟醚處理分 離出來的腦突觸體，檢測氟烷和安氟醚麻醉對大鼠離體腦突觸體Na+-K+-ATP酶活性的影響。 結果表明，不同濃度的氟烷和安氟醚對離體大鼠大腦皮質突觸體Na+-K+-ATP酶活性無影響， 超臨床劑量的氟烷和安氟醚能抑制Na+-K+-ATP酶的活性[133]o Brazaluk等(1987)研究發現 在復合麻醉劑對兔心肌各種酶活性影響，二乙酰基膽堿、氟烷和笑氣麻醉顯著的抑制對兔心 肌Na+-K+-ATP酶的活性[132]o馮征等( 1998 )檢測異氟醚麻醉對大鼠不同腦區突觸體 Na+-K+-ATP 酶活性的影響，異氟醚劑量依賴性地抑制大鼠大腦皮層、海馬、腦干和小腦突觸 體Na+-K+-ATP酶的活性，實驗證明異氟醚可能通過抑制四個腦區的Na+-K+-ATP酶活性來影 響突觸傳導、突觸興奮和突觸囊泡釋放神經遞質而發揮麻醉作用[131]o
麻醉藥可以改變組織細胞膜內外Na+，K+穩態變化，影響突觸興奮、突觸傳遞和突觸神 經遞質釋放而產生麻醉作用，大量實驗證明麻醉藥均可抑制Na+-K+-ATP酶活性[134]o目前的 研究僅局限于麻醉藥對Na+-K+-ATP酶的抑制作用。不過隨著對Na+-K+-ATP酶研究的不斷深 入，尤其是對Na+-K+-ATP酶亞型及其功能的研究，會更加清晰的闡明Na+-K+-ATP酶在全身 麻醉過程中的重要調控作用。
1.4.1.2全身麻醉對Ca2+, Mg2+-ATP酶的影響
Ca2+，Mg2+-ATP酶結合上CaM或被激酶磷酸化后可暴露出活性中心而使鈣泵活化。活 化的鈣泵在Mg2+的參與下分解1個ATP分子可將1~2個Ca2+跨膜轉移到胞外，同時以1： 2 比例將H+轉移到胞內，使細胞內外維持電中和，因此質膜兩側膜電壓差不會影響Ca2+的轉移o (1)靜脈麻醉藥對鈣泵的影響
Fomitcheva等(1996)檢測戊巴比妥鈉對大鼠小腦突觸體Ca2+，Mg2+-ATP酶活性的影響， 研究表明，戊巴比妥鈉在 100~200 倍臨床用藥濃度對 Ca2+， Mg2+-ATP 酶活性有抑制作用， 而臨床劑量Ca2+，Mg2+-ATP酶的活性沒有發生變化[137]o王鈞等(1998)檢測異丙酚麻醉對 大鼠不同腦區突觸體Ca2+，Mg2+-ATP酶的活性影響，研究發現，腹腔注射異丙酚(100 mg?kg T)后大鼠大腦皮層、腦干和海馬突觸體Ca2+，Mg2+-ATP酶活性較對照組表現出顯著性降低， 異丙酚50 mg?kgT腹腔注射，大腦皮層、腦干和海馬突觸體質膜Ca2+，Mg2+-ATP酶的活性 較對照組差異不顯著(P>0.05)，所以推測異丙酚產生全身麻醉作用可能與其抑制腦突觸體 質膜Ca2+，Mg2+-ATP酶的活性有關，并且與行為學變化呈密切相關［136］。張志龍等(2003) 檢測氯胺酮麻醉對大鼠大腦皮質和丘腦 Ca2+， Mg2+-ATP 酶活性的影響。實驗表明：大鼠腹 腔注射氯胺酮后大腦皮質、丘腦Ca2+，Mg2+-ATP酶活性降低，因此推斷Ca2+，Mg2+-ATP酶 在氯胺酮全麻作用機制中可能起重要作用［135］。
(2)吸入麻醉藥對鈣泵的影響
Franks等(1995)檢測異氟醚、氙和氧化亞氮麻醉對離體大鼠大腦突觸體Ca2+，Mg2+-ATP 酶活性影響，研究發現臨床濃度的混合麻醉劑對大鼠大腦突觸體 Ca2+， Mg2+-ATP 酶活性有 明顯的抑制作用［136］。Fomitcheva等(1996)研究發現，異氟醚可抑制大鼠小腦突觸體質膜 Ca2+， Mg2+-ATP 酶活性［137］。 Wamil 等(1996)檢測氟烷對培養大鼠脊髓、大腦皮質和脊神 經節神經元的電活性和Ca2+，Mg2+-ATP酶活性的影響，氟烷和Ca2+，Mg2+-ATP酶抑制劑能 延長神經元細胞自發去極化的時間，實驗結果表明，氟烷能抑制神經元 Ca2+， Mg2+-ATP 酶 的活性［138］。李元濤等(2005)動態觀察安氟醚吸入麻醉下SD大鼠不同時期大腦皮層、腦干 及海馬等腦區 Ca2+， Mg2+-ATP 酶活性變化和行為學變化，實驗結果顯示：在麻醉誘導期各 腦區Ca2+，Mg2+-ATP酶活性即開始下降(P<0.05)；麻醉期降至最低(P<0.01)；恢復期又 開始升高，但仍低于對照組水平。其中，僅腦干 Ca2+， Mg2+-ATP 酶活性降低有顯著性差異 (P<0. 05)；清醒時期恢復至對照組水平(P>0. 05)。且行為學變化與腦Ca2+，Mg2+-ATP酶 活性變化有關。結果表明：安氟醚產生麻醉作用可能與其抑制腦 Ca2+， Mg2+-ATP 酶活性相 關，行為學變化(麻醉深度)與抑制程度有相關性［139］。
1.4.2全身麻醉與 NO-NOS-cGMP 信號傳導系統
Goldberg等(1963)在大鼠尿中發現環鳥苷酸(cGMP) ［145］„隨著人們對一氧化氮(NO) 的深入研究才進一步揭示出cGMP在信息傳遞中的重要作用。研究表明，鳥苷酸環化酶(GC) 存在于胞漿中和細胞膜上，為cGMP在細胞信號的跨膜傳遞重要作用中提供了結構基礎［146］； 無論是細胞膜上或者是游離的鳥苷酸環化酶(sGC)作為信號轉導分子途徑成分在調節多種 生理過程中都發揮重要作用。
NO是細胞內及細胞間重要的神經遞質，發揮信息傳遞作用。NO作為一種信息物質，其 功能與興奮性氨基酸所介導的神經毒性、意識、學習、記憶等有關。L-精氨酸在NOS的作用 下生成NO, NO做為sGC內源性活化因子，促進cGMP的合成，cGMP進而參與各種生理 效應的調節。研究表明NO-NOS-cGMP信號轉導系統可能在全麻藥麻醉作用產生的分子學機 理中發揮重要作用［147］。
大鼠吸入氟烷后，小腦和其它腦區的cGMP含量明顯降低。此外，NMDA受體拮抗劑也 使吸入麻醉藥的MAC明顯降低，表明吸入麻醉藥全麻機理與NO-NOS-cGMP信息傳導通路 密切相關［148］o Rengasamy等(1997)發現異氟醚能抑制NMDA誘發的NOS活性升高，然而 氟烷卻無此作用。異氟醚和氟烷兩者均能明顯抑制NMDA誘發的cGMP產生，從而證實了 麻醉藥通過抑制神經系統的NO-NOS-cGMP信號轉導途徑產生麻醉效能，但麻醉藥對cGMP 積聚的抑制作用，與NMDA受體結合位點相互作用沒有必然的系。chinose等(1999)檢測 神經元選擇性NOS抑制劑急性或長時程處理鼠腦突觸體cGMP含量與七氟醚麻醉MAC的關 系。結果證明，經腹腔注射急性處理組七氟醚麻醉MAC和鼠腦突觸體cGMP含量的降低與 劑量呈負相關；然而慢性用藥組在麻醉后，腦突觸體cGMP含量降低與用藥時程呈負相關， 1?2d MAC出現降低，在蘇醒后逐漸恢復至正常水平[150]o
以上實驗表明，多數麻醉藥與NO-NOS-cGMP信號轉導系統有密切關系，吸入麻醉藥可 抑制NO-NOS-cGMP信息傳導通路，從而降低意識水平，增強鎮痛和鎮靜效果，產生麻醉作 用。
1.5全身麻醉中c-fos和c-jun基因的研究進展
1.5.1c-fos 和 c-jun 基因概述
c-fos、c-jun作為即刻早期基因的典型代表，在刺激后數分鐘即發生激活轉錄和表達，其 mRNA在胞質中停留時間短，立刻翻譯為fos及jun磷酸蛋白進入細胞核內。fos的半衰期為 2 h，jun的半衰期較fos長。多種因素均可引起c-fos和c-jun迅速的一過性表達[155]o在動物 實驗中證實，各種形式刺激可誘發c-fos, c-jun在中樞神經元的表達。細胞外生長因子及生 長因子受體在酪氨酸蛋白激酶存在的條件下與G蛋白結合共同發揮作用；酪氨酸蛋白激酶及 G蛋白共同作用于胞質內的蛋白激酶；進而作用于編碼轉錄因子調節蛋白的c-fos, c-jun，而 使靶基因活化啟動，產生各種蛋白[156]o c-fos, c-jun產物的靶基因是維持細胞生命所必需的 管家基因，是編碼不同細胞類型特異產物的組織特異基因。c-fos, c-jun對正常細胞的分裂、 生長、分化及信息識別發揮重要作用，調控多細胞動物細胞間公共關系基因[157-161]o
1.5.2c-fos 和 c-jun 基因表達與全身麻醉
c-fos和c-jun基因成為近些年來研究全麻藥物作用位點，進一步證明了基因學說提出的 正確性，在動物解剖學上進行全身麻醉的定位是目前全麻機理研究的重要方向，有研究表明 外周傷害性刺激能誘導大鼠脊髓神經元c-fos基因顯著表達，異氟醚對c-fos蛋白的表達有顯 著性增強作用，推測異氟醚的作用位點可能在脊髓，此外有研究證明常見吸入麻醉藥和均誘 導中樞神經元多個核團 c-fos 蛋白的明顯表達，而且與吸入麻醉藥濃度呈正相關，因此這些 核團可能是全麻藥物的中樞作用位點[162]o研究表明麻醉深度的不同可使中樞多個核團cfos 的表達出現較大差異[163]o研究集中在麻醉藥作用下c-fos, c-jun等基因表達進行定位水平， 大鼠腦以外的多個器官出現高度表達c-fos、c-jun基因，所以不能表明c-fos、c-jun基因表達 蛋白具有特異性，根據全麻狀態下相關基因在大腦中樞神經的表達分布圖，根本不能說明確 定全麻藥物的作用部位 [164]；老鼠在異氟醚麻醉狀態下，刺激迷走神經，可以誘導 c-fos、 NGFI-A 基因的顯著性表達，因此用來研究全麻機理有一定的限制性，對全身麻醉在大體動 物解剖學上的定位作深入的研究，需要有與全麻密切相關且具有顯著特異性的基因，克隆出 這些基因是深入研究的關鍵。
通過檢測全麻藥物作用下中樞神經系統 c-fos、c-jun 表達情況，與全麻作用密切相關的 神經核團可以被發現，可以推斷出 c-fos、 c-jun 參與麻醉信息傳遞的中樞通路，為闡述全麻 機制提供新的思路。研究發現多種麻醉藥單獨給藥均可引起中樞神經系統c-fos基因的表達， 但表達的程度和部位與聯合用藥有不同差異［165］o Talkagama等（1994）發現，烏拉坦、氟烷、 戊巴比妥鈉、a-氯醛糖、芬太尼、咪達唑侖誘導c-fos表達量降低，烏拉坦誘導c-fos在下丘 腦和大腦皮質區域的相關核團內表達，注射芬太尼-咪達唑侖下丘腦和大腦皮質區域c-fos表 達沒有變化。嗎啡可誘導c-fos在下丘腦腹內側核表達量增加。靜脈全麻藥氯胺酮、異丙酚 誘導的fos表達主要集中在間腦和延腦。研究發現硫噴妥鈉及吸入麻醉藥物能引起中樞神經 元多個核團fos蛋白的明顯表達［166］o吸入麻醉藥均可誘導c-fos在杏仁核、海馬區、丘腦室 旁核、視上核、中腦中央灰質及脊髓背角等神經核團內表達。推論這些核團可能是全麻藥物 中樞作用點。
麻醉藥物可抑制其他麻醉藥和應激誘導c-fos基因的表達［167］o通過檢測c-fos、c-jun的 表達可證實全麻藥物對應激的保護作用。實驗表明，分離麻醉劑可抑制腦局部缺血后c-fos 基因表達，吸入麻醉藥對傷害性刺激誘發c-fos基因表達也起到抑制作用［168］。嗎啡和咪達唑 侖能抑制傷害性刺激誘發的大腦皮質、海馬和脊髓c-fos基因的表達。Yashpal等（1998）證 實利多卡因可抑制福爾馬林疼痛模型引起的脊髓后角內c-fos基因的表達。此外，靜脈麻醉 劑異丙酚、硫噴妥鈉可明顯的抑制對傷害性刺激誘發c-fos基因表達。異丙酚能降低應激大 鼠海馬、下丘腦、大腦c-fos表達水平，并與血漿促腎上腺皮質激素、皮質醇濃度下降一致， 這表明 c-fos 參與了防止應激反應發生的分子機制，異丙酚可減小應激反應，氯胺酮的作用 則有部位上差異［169］。
1.6 試驗目的及意義
隨著小型豬作為模式化動物相關研究的廣泛開展，需要操作簡單、安全穩定、麻醉效果 可靠可控的麻醉藥物來保證各項外科操作順利的進行。目前市場上尚無完全符合要求的全身 麻醉藥物，小型豬麻醉藥物及麻醉方法都存在著一些缺點，尤其是起效和蘇醒時間、麻醉可 控性，以及藥物毒、副作用的普遍存在，使其很難滿足不同手術的麻醉要求，所以迫切需要 開發一種理想的麻醉藥物和方法來滿足小型豬麻醉的需求。
乳化異氟醚在犬、兔、鼠等動物中應用的實驗研究表明，異氟醚以脂肪乳為載體佐劑， 在許多動物上通過靜脈注射已經取得良好的局部和全身麻醉效果。在技術操作和麻醉效果方 面體現出了獨特的優勢，是吸入麻醉和靜脈麻醉所不具備的。鑒于此，開展了乳化異氟醚在 小型豬全身麻醉中應用探索，通過反復多次的實驗摸索，通過調整乳化異氟醚靜脈注射速度， 使小型豬達到了臨床理想的麻醉狀態，在麻醉過程中表現出麻醉深度可控、蘇醒時間短，無 副作用等特點，并且麻醉成本低廉。
麻醉劑的臨床應用與其全麻機理的研究往往是同步開展的。目前藥物麻醉機理已成為麻 醉研究的熱點，分子生物學技術，電生理學技術以及計算機技術的迅猛發展，大大促進了全 麻機理的研究。掌握麻醉劑的麻醉機理，有助于對整個麻醉過程有清晰的認識，給予麻醉工 作用藥建議，便于制定安全可靠麻醉方案。基于此，本實驗進一步對乳化異氟醚的麻醉機理 進行了深入研究。
本實驗的目的有以下三個方面：
1、 探討乳化異氟醚在小型豬全身麻醉中應用的可行性。
2、 評價乳化異氟醚進行小型豬全身麻醉的可靠性和安全性
3、 從多角度闡述和分析乳化異氟醚靜脈應用的麻醉機理。
2材料和方法
2.1試驗材料
2.1.1試驗動物
巴馬豬18頭，雌雄各半，體重24. 36±5. 52 kg，雙鴨山尖山小型豬養殖場提供。同一條 件下飼養一周后臨床檢查健康個體，實驗前12h禁食，自由飲水，重復麻醉需要間隔7d以上。
Wister大白鼠108只，雌雄各半，220. 18±22.05 g，長春市伊斯實驗動物技術有限責任 公司提供。同一條件下飼養2周后試驗。試驗前將大鼠安置在安靜、避強光的環境中飼養24 h 以上。
2.1.2試驗儀器
Philips 監護儀（MP30,荷蘭 Philips 公司）；
Datex 呼吸監護儀（CardiocapTMIICH 型，芬蘭 Datex Engstrom 公司）；
日本光電腦電圖機EEG-9200K （日本光電工業株式會社）；
微量靜脈注射泵（SP-500型，JMS公司）；
Syngene 凝膠成像分析系統（北京澤研科技有限公司）；
高速低溫離心機（德國Sigma公司）；
組織切片機（KD-3358,金華科爾諾電子科技有限公司）；
超低溫冰箱（美國Thermo公司）； 恒溫培養箱（上海躍進醫療儀器有限公司）； 分光光度計（北京中西遠大科技有限公司）； 蛋白電泳系統（北京科思佳公司）；
Beckman255型自動PH計（美國Beckman公司）；
Olympus倒置顯微鏡（CKX41,日本奧林巴斯公司）； 酶標儀（美國BioTek公司）；
海爾冰箱（287BCD，海爾公司）； 恒溫震蕩培養箱（上海凱朗儀器設備公司）； 高壓蒸汽滅菌鍋（杭州匯爾儀器設備有限公司）； 液氮罐（成都液氮罐廠）；
微量移液器（法國吉爾森公司）；
X-OMAT BT膠片（柯達公司）； 玻璃勻漿器、計數器、防脫玻片。
2.1.3試驗藥品和試劑
異氟醚（河北九派制藥股份有限公司，批號 20110508）； 30%脂肪乳（江西瑞華藥業有限公司，批號 20110825）； 丙泊酚注射液（西安力邦制藥有限公司，批號20111006）； 丙烯酰胺（上海伯奧生物科技有限公司）；
N，N'-甲叉雙丙烯酰胺（上海伯奧生物科技有限公司）；
NC膜（美國Sigma公司）；
轉印濾紙（迪申生物技術有限公司）；
NMDAR2B抗體（美國santa公司，貨號sc-9057）；
nAChRa4抗體（美國santa公司，貨號sc-5591 ）；
P-actin單克隆抗體（美國santa公司，貨號SC-130656）；
C-jun蛋白一抗（美國santa公司，貨號SC-1694）；
C-fos蛋白一抗（美國santa公司，貨號SC-52；
辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG （美國santa公司，貨號ZB-2305）；
DAB （中杉金橋生物，貨號ZLI-9031）、胰蛋白酶（北京格源天潤生物技術有限公司）、
DNA Maker （貨號 D0107）、PMSF （貨號 ST506）, RIPA 裂解液（貨號 P0013E）；
DEPC （貨號 ST036）, TEMED 原液（貨號 ST728）, Tween-20 （貨號 ST825）；
Tris （貨號 ST761）、甘氨酸（貨號 ST085）, SDS （貨號 ST626）；
超敏ECL化學發光試劑盒（碧云天，貨號：P0018）；
無水乙醇、二甲苯、脫脂奶粉、固體石蠟。
2.2 試驗方法
2.2.1小型豬乳化異氟醚麻醉最小輸注率篩選實驗
2.2.1.1動物準備和麻醉方法
（1） 注射速度范圍設定： 2.2、 2.3、 2.4、 2.5、 2.6、 2.7、 2.8、 2.9、 3.0 ml/kg.ho
（2） 麻醉方法：小型豬經丙泊酚（3.5 mg/kg）靜脈注射30-45 s誘導至眼瞼反射遲鈍，出現 翻正反射消失，連接靜脈注射泵，以預設注射速度進行靜脈麻醉維持，通過測定鎮痛效果， 不斷調整注射速度。
2.2.1.2測定方法
（1）注射速度調整：采用自身交叉法和 Dixon-Mood 法（序貫法）
1）自身交叉法：麻醉過程中根據每個個體麻深度向上或向下調整注射速度，速度調整幅 度為0. 1 ml/kg. h，并維持5 min后進行下一次調整，直至動物進入良好的鎮痛狀態。
2）序貫法：試驗注射速度以上一次實驗的最佳注射速度為基礎進行麻醉，然后根據麻醉 深度采用自身交叉法進行最佳注射速度的調整。
（2）鎮痛效果判定方法：通過止血鉗鉗夾蹄冠和鼻盤來進行痛覺測定，如動物表現不安、掙 扎、嚎叫說明無鎮痛效果，標記為陽性；如動物對外界刺激表現安靜、無掙扎，且生命體征 正常，證明鎮痛良好，標記為陰性。
（ 3 ）數據記錄：記錄每頭小型豬以不同注射速度進行維持時的鎮痛效果（陽性或陰性）。
（4）最小輸注率的確定：以所有實驗個體表現出良好麻醉效果，生命體征無異常的最低注射 速度為小型豬乳化異氟醚最小輸注率。
2.2.2小型豬乳化異氟醚麻醉監測實驗
2.2.2.1試驗動物分組和麻醉方法
（1） 試驗動物分組：同2.2.1.1。
（2） 麻醉方法：小型豬經丙泊酚3. 5mg/kg靜脈麻醉誘導至眼瞼反射遲鈍，出現翻正反射消 失后，以2. 80 mL/kg. h最小輸注率進行麻醉維持，在麻醉過程中進行臨床麻醉指標的監測， 包括：一般生理指標；呼吸和循環系統指標；心電圖；腦電圖監測。
2.2.2.2測定方法
指標監測時間點： 麻醉前、乳化異氟醚注后10、20、30、45、60、80 min。
（1） 一般監測指標
1） 體溫（T）：用重癥監護儀體溫探頭置入小型豬直腸內進行測量。
2） 呼吸數（RR）：觀測腹壁起伏運動進行監測。
3） 心率（HR）：用監護儀連接各導聯進行監測。
4） 生物反射 眼瞼反射：用硬毛茬輕觸眼瞼，檢查是否出現躲閃、閉眼、眨眼等現象； 角膜反射：用硬毛茬輕觸角膜，檢查是否對刺激反應明顯，出現眼球收縮、顫動、眨眼
等現象；
肛門反射：用注射針頭輕刺動物肛門，檢查時候表現為明顯的肛門收縮；
5） 鎮痛效果 針刺和鉗夾鼻盤、耳廓、腹壁、四肢蹄冠皮膚，檢查疼痛反應；
6） 鎮靜效果 敲打保定臺，觀察豬的反應，檢查睜眼、耳動、肢體抽動、抬頭、尾動、掙扎等現象。
7） 肌松效果 觀察口腔打開、舌體脫出、腹壁松弛程度；牽拉及屈曲四肢阻力；尾部搖擺情況；
（2） 循環系統指標
1） 血氧飽和度、心率：將脈搏血氧飽和度傳感探頭置于剃毛的耳廓基部監測脈搏血氧
飽和度、心率的變化；
2） 無創血壓：將重癥監護儀的袖套放置到豬的前肢肘關節處監測豬的無創血壓，包括 收縮壓、舒張壓、平均動脈壓；
（3） 呼吸系統指標
小型豬在麻醉后，將特制呼吸面罩罩住鼻盤及口，將裝置連接在Datex呼吸監護儀上。 監測指標：RR （呼吸頻率）、MV （每分通氣量）、TV （潮氣量）、PetC02 （呼吸末二氧 化碳分壓）、 PetISO （呼吸末異氟醚濃度）。
（4） 心電圖（ECG）監測
操作方法：五個導聯分別置于左右前肘腋窩下，胸骨突偏右3cm，左右體側中線與肋弓 外緣交叉點。導聯電極為9#號鋼針頭，電極放置部位剪毛消毒后，將滅菌的電極刺入皮下加 以固定，連接到重癥監護儀上進行監測，定標走紙速度為25mm/s,標準電壓lmV/mm,打 印和記錄心電圖。
監測主要指標：II導聯心電波型。
（5） 腦電圖（EEG）監測
操作方法：小型豬經丙泊酚誘導前將腦電圖機設置完畢，參數設置：電壓100mV,持續 時間10ms,誘導至翻正反射消失轉至手術臺上，連接靜脈泵進行乳化異氟醚注射和5個腦電 電極的安裝。電極使用9號鋼針頭，電極部位剪毛消毒后，將電極刺入皮下至少5mm,軟件 EEG9000 中設置監測電極排布，連接后進行動態腦電圖跟蹤分析。
電極部位：按圖連接電極Z, FP1、FP2, A1, A2o見圖1-1。
Figure 1-2 EEG lectro-pad connection diagram in pigs 電極排布： Z-A1、 Z-A2、 FP1-A1、 FP2-A2。
監測指標：FP1-A1和FP2-A2波幅、頻率、腦電波形。
2.2.2.2數據統計方法
一般生理指標、呼吸和循環指標用平均值土標準差（X±SD）表示，采用SPSS18.0進行
數據分析處理，差異顯著性分析采用Duncan式方差分析，P<0. 05為差異顯著，P<0. 01為 差異極顯著。
2.2.3乳化異氟醚麻醉的中樞細胞信號轉導機制的研究
2.2. 3. 1乳化異氟醚對中樞突觸體ATP酶活性的影響
（1）試驗分組
Wistar大鼠36只，分為三組，隨機取12只為脂肪乳對照組，尾靜脈注射30%脂肪乳； 試驗組，分為翻正反射消失組（麻醉組）和翻正反射恢復組（恢復組），各12只，分別經尾 靜脈以2. 7mL/kg. min 注入乳化異氟醚。
對照組（12只）
麻醉組（12只）
恢復組（12只）
圖2-1實驗分組流程圖
Fig 2-1 Flow chart of experimental grouping
（2） 麻醉方法
乳化異氟醚以大鼠全麻的最低輸注率（MIR） 2. 7mL/kg. min進行尾靜脈注射。
大鼠MIR測定方法：12只大鼠尾靜脈注射7%乳化異氟醚，每次調整0. 2mL/kg. min, 每次調整注射速度后維持20min,直到調整到鉗夾尾部60s沒有掙扎反應時最低輸注速度， 12只大鼠最低注射速率的平均值為大鼠乳化異氟醚麻醉最低輸注率（MIR）。
（3） 樣本采集
1） 對照組：大鼠用自制保定盒保定好，經尾靜脈注射30%脂肪乳2. 7mL/kg. min,持續 注射4min,約注入2mL脂肪乳，然后立即將大鼠斷頸分離腦組織，采集過程中腦組織保持 在生理鹽水冰面上，迅速分取雙側大腦皮層、小腦、腦干、海馬及丘腦，將樣品裝入凍存管 做好標記放入液氮中保存。
2） 麻醉組：當以MIR持續靜脈注入乳化異氟醚，大約20min后動物出現翻正反射消失, 斷頸取腦組織，分離腦組織條件和方法同對照組。
翻正反射消失判定標準：將保定盒翻轉，當大鼠不隨著翻轉調整體位，用腸鉗鉗夾尾尖 30s動物無任何疼痛反應時判為翻正反射消失期。
3） 恢復組：停止注射乳化異氟醚4min左右，密切觀察大鼠狀態，當大鼠出現翻正反射 恢復，立即斷頸取腦組織，分離腦組織的條件和方法同對照組。
翻正反射恢復判定標準：當大鼠從仰臥狀態轉向四肢屈曲開始翻回正常體位為翻正反射 恢復。
(4)樣品處理及檢測方法
1)組織蛋白制備和測定：從液氮罐中將不同腦區的腦組織取出，準確稱重后按重量體積 比1 ： 9置入預冷的生理鹽水溶液中制成10%勻漿，然后4°C1500rpm離心10min,取上清 0.2mL 加 0.8mL 生理鹽水稀釋成 2%的勻漿待測。同時用考馬斯亮蘭試劑測定 2%組織蛋白 濃度。
2)組織ATP酶活力測定：應用比色法測定Na+-K+-ATP、Ca2+-ATP和Mg2+-ATP活性， 操作方法參照ATP酶測定試劑盒。酶活力以每小時每毫克組織蛋白的組織中ATP酶分解ATP 產生1umol無機磷的量為一個ATP酶活力單位，單位用|umol Pi?mg-1 (prot) • h-1表示。
ATP酶=測定管OD值對照管OD值 標準管磷含量x反應體系樣本稀釋倍數x 6 酶= 標準管OD值 X 樣本蛋白濃度
2.2. 3. 2乳化異氟醚麻醉對中樞神經系統NO-NOS-cGMP信號轉導系統影響
(1)實驗分組同ATP酶活性測定2.3. 1. 1中1。
(2)樣本采集同ATP酶活性測定2.3. 1. 1中2。
(3)待測樣本處理和NO產量、NOS酶活性測定方法
1)待測樣本處理
將不同腦區的腦組織稱重后按重量體積比1:9置入預冷的勻漿生理鹽水中制成10%組織 勻漿，樣品離心(NO： 1000rpm, 10min； NOS： 2500rpm, 10min； cGMP： 1000g, 10min), 取上清液保存在1.5mLEP管，-80C冰箱中保存，待測。
2)NO產量和NOS活性的測定
采用比色法測定測定各管OD值，根據公式計算NOS活性和NO產量。NOS酶活性定 義為每毫克組織蛋白每分鐘生成的NO nmol數，即nmol?mg-1 (protein) •min-1o
NO 含量計算公式：
樣品OD值-空白OD值x標準品濃度(20如。1/Z)x樣品稀釋倍數
標準品OD值-空白OD值X 樣品蛋白濃度(gprot/L)
S 活性計算公式：
測定管OD -空白管OD x反應液總體積x 1 x 1
呈色物納摩爾消光系數乂取樣量 X比色光徑x反應時間X待測樣品蛋白濃度mgprot/L)
3)樣本處理和cGMP含量測定方法
通過固相夾心法酶聯免疫吸附試實驗測定，操作步驟如下：
①標準品配制：將 400nmol/L 的 cGMP 標準品進行倍比稀釋為 200、100、50、25、
12.5nmol/L；
②加入稀釋好后的標準品50uL于酶標板標準品反應孔內，加50uL樣品于樣品反應孔 內，然后快速加入的生物素標記抗體50uL,蓋上膜板蓋，振蕩均勻，37°C避光孵育1ho
③用洗板機洗滌，洗滌4 次；
④每孔加親和鏈霉素-HRP60uL,振蕩均勻，37C孵育30min；
⑤用洗板機洗滌，洗滌4 次；
⑥每孔各加50uL底物，振蕩均勻，37C避光孵育10mino
⑦酶標板取出，加入終止液50uL,加入終止液后進行最終測定。
⑧在波長450nm處用酶標儀讀取各孔的0D值。
cGMP濃度計算：相應的cGMP標準品濃度和吸光度0D值分別為橫坐標和縱坐標，得 到相應cGMP標準曲線，樣品中cGMP含量可根據其0D值由標準曲線計算出相應濃度，再 乘以樣品稀釋倍數就得到組織中cGMP含量。
2.2.3.3數據統計方法
實驗數據用平均值土標準差(X±SD)表示，采用SPSS18.0進行數據分析處理，差異顯 著性分析采用Duncan式方差分析，P<0. 05為差異顯著，P<0. 01為差異極顯著。
2.2. 4乳化異氟醚麻醉對NMDAR2B和nAChRa4表達的影響
2.2.4.1試驗分組
同ATP酶活性測定2.2.3. 1o
2.2.4.2樣本的采集
(1)麻醉方法：同ATP酶活性測定中的2. 2. 3. 2,每組12只大鼠。
(2)當大鼠進入相應麻醉時期麻后，將大鼠放置在生理鹽水凍至的冰面上，打開胸腔，暴 露心臟，分離前、后腔靜脈，結扎近心端，剪開前、后腔靜脈。由左心室插入頭皮針至升主 動脈，進行心臟灌注。
(3)內固定：先用100-150mL生理鹽水灌注1h,至流出液透明清亮無血液，肝臟會變成白 色，改用 4%多聚甲醛 300mL 灌注 2h。
(4)分離出大腦皮質、小腦、腦干、丘腦、海馬組織，等待外固定。
2.2.4.3樣品處理及檢測方法
(1)外固定
各腦區組織用4%的多聚甲醛分開進行，固定時間4°C過夜。固定上述腦區組織時，應慢 慢放入固定液中。組織塊不能使之直接接觸容器的壁和底，可用脫脂棉或紗布墊于底和壁上， 固定液量一般不少于組織總體積的4 倍。
(2)水洗 固定好組織后，用去離子水進行水洗。
(3)脫水
1) 70%酒精 大于 3h
2) 80%酒精 大于 3h
3) 90%酒精 大于 3h
4) 95%酒精 大于 3h
5) 100%酒精 1h
6) 100%酒精 1h
4) 透明
二甲苯 I (15min)二甲苯 II (15min)。
(5)浸蠟
將組織經過媒劑透明之后，移入54~56C之間熔化的石蠟內浸漬1-2h。浸蠟的時間不宜 過長，過長則可造成組織的脆硬，致使切片破碎。浸蠟的時間也不宜過短，浸蠟不足亦難以 切成完好的切片。
(6)包埋
先將熔化的石蠟傾入組織包埋框內，隨即將浸蠟后組織塊用鑷子送置于包埋框內的等溫 石蠟中。注意將切面朝下放，放平放正；組織埋好后，稍待片刻，放入冰水中，等到石蠟凝 固，將包埋框打開，再用刀片把一塊塊已經包好組織的石蠟塊的周邊修切完整，組織外圍的 石蠟留出1-2mm左右空間。
(7)石蠟切片和附貼
將修整好的石蠟組織塊固定在切片機臺面，設置切片厚度5gm。切片附貼時，將切片取 下立即放入42C恒溫水槽中并平攤于水面之上。用鑷子細心地將連續切片間大皺折攤開，然 后再將水溫調高到45C左右，使切片因水溫的增高而舒張地伸展于水面上。選取其中最完整 的、沒有皺折的切片，附貼于已經清洗好的防脫載玻片上，做好標記。
(8)烘干
切片附貼后需要烘干，一般是在37C過夜。脫蠟前，切片60C溫箱內放置1ho
9) 脫蠟
1) 二甲苯I 10min
2) 二甲苯II 10min
3) 100%酒精 10min
4) 95%酒精 5min
5) 90%酒精 5min
6) 80%酒精 3min
7) 70%酒精 3min
8) PBS 洗片 5minX3 次
10)免疫組化試劑盒操作方法
1)3%過氧化氫去離子水洗10min,濕盒避光，以消除內源性過氧化物酶活性。
2)0. 01M PBS 洗 3 次，每次 5mino
3） 封閉液10%山羊血清-PBS封閉1ho
4） 滴加一抗：NMDAR2B和nAChRa4抗體按1:100稀釋，用50pL移液器逐滴加在切 片上，4°C濕盒過夜；空白對照片滴加封閉液。
5） 0. 01MPBS 洗 3 次，每次 5mino
6） 滴加二抗，兔抗鼠二抗按1:5000稀釋濕盒避光30min。
7） 0. 01MPBS 洗 3 次，每次 5mino
8） 滴加DAB,在鏡下觀察，當切片部分出現顏色變棕黃色顆粒，立即用蒸餾水洗5min, 終止染色。
9） 蘇木素復染10秒。
11） 脫水
1)100%酒精 5min
2)100%酒精 5min
3）二甲苯 I 5min
4）二甲苯II 15min
12） 樹膠封固
滴1-2滴樹膠在組織切片上，用清潔的蓋玻片封固切片，然后平放自然風干。
（13） 鏡檢
每個麻醉時期（包括對照組）選3張切片，每張切片在光鏡下（400x）隨機選取5個陽性 細胞表達均一的視野進行細胞計數。
2.2.4.4數據處理與分析
反應陽性細胞數用平均值土標準差（X ±SD）表示，采用SPSS18.0進行數據分析處理， 差異顯著性分析采用Duncan式方差分析，P<0. 05為差異顯著。
2.2. 5乳化異氟醚麻醉對c-fos和c-jun蛋白表達影響
2.2.5.1 試驗動物分組
同ATP酶活性測定2.2.3. 1o
2.2.5.2樣本的采集
同ATP酶活性測定中的2. 2. 3.2o
2.2.5.3腦組織樣品總蛋白提取
（1） 提取方法：
采用RIPA裂解方法提取腦組織中總蛋白。
（2） 操作步驟：
1）取不同腦區的組織（大腦皮質、小腦、丘腦、腦干、海馬）0.04g于2mL圓底EP管
2)融解Western及IP細胞裂解液，混勻。取適量的裂解液，在用前數分鐘內加PMSF, 最終濃度為 1mM。
3)取含PMSF裂解液100uL加入裝組織的EP管中，用微量勻漿器勻漿，至充分裂解。
4)充分裂解后，EP管經12000g離心5分鐘，取上清60uL左右，勿吸出沉淀。
5)先把樣品緩沖液和DTT (1mol/L二硫蘇糖醇)按照9:1比例混勻。然后把樣品按照1： 3的比例加到樣品緩沖液(含DTT、的EP管中，煮沸5min,待冷卻，取上清，轉至1.5mLEP 管中。置于-20C冰箱中待檢測。
2.2.5.4腦組織樣品總蛋白濃度測定
測定方法見2.2.3.1 中(4)中1)。
2.2.5.5制膠
( 1 )制膠材料配制方法
1) 濃縮膠液體：Tris 12 g溶于60 mL雙蒸水中，用1 mol /L HCI調至pH 6. 8,再加水 稀釋到100 mL的終體積，即成1.0 moL/L tris-HCL緩沖液。0. 22口m膜過濾后，在4C下保 存備用。
2) 分離膠液體：Tris18.3 g加入24 mL的HCl (1 mol/L)中，調節PH值8. 8,加雙 蒸水至100 mLo 0. 22口m膜過濾后，在4C下保存備用。
3) 10%過硫酸胺：0.1 g過硫酸胺溶解于1mL雙蒸水中，當天配制，放置不超過7d。
4) 5xSDS-PAGE緩沖液：15.1 g Tris (0. 125M), 94 g甘氨酸(1.25M), 10 g SDS (0. 5M),加蒸餾水至800 mL,用濃HCl調pH值至8. 3后加水至1L,室溫下保存。
5)10% SDS液：SDS l. 0 g加于10 mL雙蒸水中。
6)5x上樣緩沖液配方：
①1mol/L Tris-HCL緩沖液液0.6 mL, pH 6. 8；
②50%甘油 5 mL；
③10% SDS 液 2 mL；
④二疏基乙醇0.5 mL；
⑤1% 溴酚藍1 mL；
⑥蒸餾水0.9 mL,混勻。
7) 轉膜液：Tris堿3.0 g、甘氨酸14.48 g,加甲醇200 mL,加水定容為1 L。
8)封閉液：脫脂奶粉5.0 g溶于100 mL TBS-T中，4 C下可放置7d。
9) 5xTBS緩沖液：12.1 g Tris堿，40 g NaCl溶于雙蒸水中，用濃HCl調pH值至7. 6 后，用雙蒸水定容至1 Lo室溫保存，臨用前稀釋5倍。
10) TBS-T漂洗液：量取1xTBS緩沖液1000 mL,加入1 mL的Tween-20。
11)30%丙烯酞胺溶液：稱取29 g丙烯酞胺，1g N, N'-甲叉雙丙烯酰胺溶解于100 mL 雙蒸水中，用0.22 gm濾后使用。
(2) 制膠步驟
分別制備12%分離膠和5%積層膠。
1)用洗滌劑、蒸餾水將四塊玻璃板清洗干凈后，放于烘干箱烤干，擦拭一遍電泳槽、 梳子及切膠板。將玻璃板放置在制膠架上相應的玻璃槽內，兩板間隔約0.75 mm,形成玻 璃板夾心制膠模，扣緊玻璃板，以防漏膠。
2)在50 mL離心管中配制分離膠溶液，選擇配制分離膠溶液的濃度為12%，總體積 為10 mLo分離膠的溶液成分為：雙蒸水3.3 mL, 30%丙烯酰胺溶液4 mL, 1.5 mol/L Tris
(PH8. 8) 2.5 mL, 10% SDS 0. 1 mL, 10%過硫酸胺0.1 mL, TEMED原液6 pLo
3)加TEMED后，充分混勻，用1 mL的移液槍將膠溶液灌注至玻板夾心，預留灌注 積層膠所需空間，然后取0.6mL蒸餾水加在膠溶液上面。電泳槽內加入雙蒸水進行水封 膠面。40 min左右，可見水封層與分離膠之間有明顯界面出現。
4)倒掉分離膠上面的雙蒸水。
5)在15mL離心管中配制5%的積層膠：吸取雙蒸水3.4 mL, 30%丙烯酰胺溶液0.53 mL, l. 0 mol/L Tris (PH6. 8) 0. 63 mL, l0% SDS 0. 05 mL, 10%過硫酸胺0. 05 mL, TEMED 3pLo加入TEMED充分混勻后，用1 mL移液槍立即灌入玻板之間(分離膠之上)
6) 積層膠加入到距離玻璃板上端約2 mm處，把梳子插入兩玻板之間，再取積層膠 溶液向梳子與玻板之間補加，直到加至短玻板上端。靜置50 min,等膠凝聚，拔出梳子， 上樣電泳。
2.2.5.5電泳
(1)拔掉梳子，將凝聚膠移到電泳槽中，倒入電泳液至固定刻度線，按測定順序于每個 梳孔加處理完樣品20uL及蛋白Marker (P-Actin) 5uL。
(2) 蓋上電泳槽蓋，打開恒壓電泳儀，設置電壓150V,時間50min。
(3)倒掉上面電泳槽中電泳緩沖液，從電泳裝置上卸下玻璃板，放在濾紙上。用切膠板 撬開玻璃板，在靠近左邊第一個加樣孔處切去一角標定凝膠方位。
2.2.5.6轉膜
(1) 剪一塊與凝膠大小相同的NC膜，另剪取專用于轉膜的濾紙，大小參照NC膜。NC 膜、濾紙和棉墊在使用前需要浸泡于轉膜液中不少于20mino
(2)組裝轉印夾層組合：依次為黑色夾板、棉墊、3層濾紙、凝膠、硝酸纖維膜、3層濾 紙、棉墊、透明夾板。將組裝好的夾層組合放入轉印槽中，并使膜靠近正極(陽極，紅色 電極)
(3)條件：350 mA, 4C, 60 min,轉印完成后在NC膜上做記號，將NC膜放在搖床上， 用 TBST 洗 5min°
(4)用5%脫脂奶粉封閉液封閉膜上的非特異蛋白，37C恒溫搖床上搖2 h, c-fos蛋白一 抗按照1:300稀釋，c-jun蛋白一抗按照1:400稀釋，P-actin蛋白一抗按照1:400稀釋，用稀釋 后的一抗封閉孵育，搖床4C過夜。
(5)取出膜，TBST液清洗3次，每次5 mino
(6) 羊抗兔二抗用TBST按1:10000稀釋，用稀釋后二抗封閉，室溫在搖床內孵育2 ho取 出二抗封閉后的膜用TBST液清洗3次，每次15 min。
(7)在暗室中將ECl高靈敏發光試劑盒中兩種顯色底物1：1等體積混合，將混合物用移 液器滴蓋在NC膜表面，片刻，搖晃使均勻，然后X光片曝光、顯影，定影，顯影膠片在 凝膠成像系統中掃描條帶。
上述試驗在相同條件下均重復3次以上。
2.2.5.7數據統計方法
用ImageJ2x software對膠片上的每一電泳條帶進行灰度值定量掃描，用檢測膠片中基 因蛋白與內參蛋白條帶的灰度值之比來代表蛋白含量，即用c-fos/B-actin、c-jun/p-actin來 表示。結果為用平均值士標準差X ±SD)表示，用SPSS18.0作統計分析，差異顯著性分 析采用Duncan式方差分析，PV0. 05為差異顯著，PV0. 01為差異極顯著。
3結果與分析
3.1小型豬乳化異氟醚麻醉最小輸注率篩選實驗
當乳化異氟醚以2. 20?2. 40mL/kg. h速度進行小型豬麻醉維持時，多數小型豬不能達到 外科手術麻醉狀態，在針刺和鉗夾鼻盤和四肢蹄冠出現較強烈反抗，但以2. 50~2. 70mL/kg. h 注射速度時，小型豬的鎮痛效果逐漸加強，刺激陰性的小型豬比例有62.5%上升到91.7%， 對外界疼痛刺激由開始的遲鈍逐漸轉向消失，從2. 8mL/kg. h開始在維持麻醉過程中所有動 物均達到了理想的外科手術麻醉狀態，并且小型豬生命體征未出現大的影響，實驗證明以 2. 80~3.00mL/kg.h范圍內小型豬在維持麻醉過程中都是安全的，小型豬蘇醒后沒有任何不良 反應，實驗中當把速度提高到3.50mL/kg.h以上，有部分小型豬出現嚴重呼吸抑制和暫停， 需要及時停止注射，加快肺部蓄積異氟醚的排出。實驗結果表明，乳化異氟醚在小型豬進行 全麻時最小輸注率為2. 80mL/kg. h,臨床應用推薦范圍為2. 80~3. 50mL/kg. h,各注射速度小 型豬疼痛測定實驗結果見表3-1o
表 3-1 小型豬在乳化異氟醚不同注射速度下疼痛測定實驗 (n=14)
Table 3-1 The test of miniature pigs pain determination anesthesiaed by emulsified isoflurane in
different injection speed
乳化異氟醚注射速度(mL/kg. h)
2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 2.7 2.8 2.9 3.0
陽性數 2 3 3 3 2 1 0 0 0
陰性數 0 1 3 5 8 11 14 14 14
3.2小型豬乳化異氟醚靜脈麻醉監測實驗
3.2.1一般監測指標監測結果
小型豬麻醉過程一般監測部分指標發生變化，呼吸數變化顯著，具體結果見表3-2o
小型豬經丙泊酚誘導3. 5mg/kg,乳化異氟醚以最小輸注率2. 8mL/kg. h進行維持麻醉。在 維持麻醉過程中監測一般監測指標中心率變化較平穩，僅在注藥后10min有一個升高過程， 但是較麻醉前無明顯差異；體溫在注乳化異氟醚后一直呈下降趨勢，在注藥后60min后體溫 較麻醉前有顯著差異，呼吸數在注藥后即由麻醉前56. 43±5. 96次/min下降到26. 88±4. 31次 /min,較麻醉前有極顯著差異(P<0. 01),整個過程小型豬呼吸較平穩，一直在26~37次/min 浮動(P<0.05),沒有發生呼吸抑制情況。
表 3-2 小型豬乳化異氟醚麻醉一般指標監測結果 (n=14)
Table 3-2 General monitoring results of miniature pigs anesthesiaed by emulsified isoflurane
時間點 RT HR RR
(min) (°C) (times/ min) (times/ min)
0 38.91士0.56 107.86士13.45 56.43士5.96
10 38.70士0.58 138.88士14.66 26.88士4.31**
20 38.48士0.60 119.00士18.83 34.00士6.74*
30 38.24士0.60 103.88士21.55 34.25士8.87*
45 37.98士0.62 112.88士17.60 35.75士7.48*
60 37.79士0.59* 111.50士19.73 29.25士8.37*
80 37.41士0.68* 107.50士14.74 37.00士7.48*
注：**代表與Omin比較PVO.O1,差異極顯著； *代表與 0min 比較 P<0.05， 差異顯著。
Note: ** denote the differences compares with 0 min were extremely significant， P<0.01; *denote the differences compares with 0 min were significant， P<0.05.
小型豬在乳化異氟醚麻醉維后5min后即進入麻醉期，整個過程中所有受試動物各項監 測指標穩定，鎮痛、鎮靜和肌肉松弛度均滿足臨床常規手術的要求。小型豬生物反射、鎮痛 鎮靜和肌松效果監測結果的描述見表3-3。
表 3-3 小型豬乳化異氟醚麻醉下各項常規監測指標監測結果
Table 3-3 General monitoring results of miniature pigs anesthesiaed by emulsified isoflurane
監測指標 方法 動物表現
眼瞼反射 沒有出現躲閃、閉眼、眨眼等現象
生物反射 角膜反射 有眼球收縮、顫動、眨眼等現象
肛門反射 有明顯的肛門收縮
針刺 無任何疼痛反應
鎮痛效果 鉗夾 無任何疼痛反應
鎮靜效果 聲音刺激 未出現睜眼、耳動、肢體抽動、抬頭、 尾動、掙扎等現象
舌體脫出無阻力、腹壁松弛程度良好、 牽拉及屈曲四肢阻力無阻力、
肌松效果 牽拉 尾部無自主擺動
3.2.2循環系統指標監測結果
小型豬麻醉過程循環系統監測指標總體變化趨勢平穩，僅平均動脈壓在麻醉后10min有 顯著變化，具體結果見表 3-4。
表 3-4 小型豬乳化異氟醚麻醉循環系統指標監測結果 (n=14)
Table 3-4 The result of circulatory system miniature anaesthetized by emulsified isoflurane
時間點 SpO2 SAP DAP MAP
(min) (%) (mmHg) (mmHg) (mmHg)
0 97.57±2.20 110.60±8.01 79.40±4.56 89.33±8.80
10 94.00±4.29 98.17±8.12 44.33±20.04* 67.43±25.98*
20 92.50±7.13 108.43±9.57 53.14±15.37* 73.14±16.20*
30 93.50±5.27 104.43±7.53 50.57±16.66* 69.43±13.79*
45 94.38±4.80 97.83±6.99 38.67±6.15** 68.25±20.00*
60 91.50±7.31 105.50±7.54 52.75±16.41* 70.50±12.66*
80 92.88±6.53 98.88±10.54 47.50±17.29* 65.25±17.05*
注：統計分析標記同表 3-2o
Note: statistical analysis symbol is samilar to table 3-2.
乳化異氟醚維持麻醉過程中小型豬 SpO2 的出現輕微降低，在整個監測過程變化浮動較 小，都保持在91%以上；SAP、DAP、MAP變化趨勢相同都是在注藥后10min時下降，SAP 較正常時無顯著性差異，DAP、MAP與正常時比較有顯著差異(P<0. 05),DAP在注藥后45min 又出現一次下降，SAP在整個麻醉過程中較正常水平無顯著差異，DAP、MAP在監測過程中 較麻醉前均有顯著性的差異。
3.2.3呼吸系統指標監測結果
表 3-5 小型豬乳化異氟醚麻醉呼吸系統指標監測結果 (n=14)
Table 3-5 Monitoring results of miniature pigs systema respiratorium anaesthetized by emulsified isoflurane (n=14)
時間點 MV TV PetCO2 CetISO
(min) (L/min) (mL) (mmHg) (%)
0 40.96±9.25 732.20±112.08 40.80±4.66 0.00
10 13.09±5.12** 483.25±106.57* 43.38±4.93 0.45±0.13
20 10.81±4.35** 328.13±85.74** 40.38±5.63 0.43±0.15
30 12.00±4.12** 350.38±98.39** 44.13±6.42 0.43±0.15
45 12.33±5.12** 346.88±106.79** 42.88±6.17 0.48±0.12
60 12.33±5.65** 421.25±109.66** 44.13±6.36 0.50±0.23
80 12.18±4.87** 337.50±119.16** 41.00±6.39 0.47±0.14
注：統計分析標記同表 3-2o
Note: statistical analysis symbol is samilar to table 3-2.
乳化異氟醚麻醉過程中，MV在注藥后下降幅度較大，由26. 96±9. 25 L/min下降到 13.09±5.12 L/min,較麻醉前有極顯著差異(P<0. 01),在整個麻醉監測過程中MV 一直處于 10-12L/min之間，變化浮動較小；TV變化與MV變化趨勢相同，在麻醉維持過程中TV較 麻醉前減低，在注藥20min后至停藥TV與對照組比較具有極顯著差異(P<0. 01)。PetCO? 在整個麻醉監測過程中變化幅度輕微，各個監測時間點與麻醉前相比無顯著性差異
(P>0. 05)；在乳化異氟醚麻醉監測過程中CetISO變化浮動較小，維持在0.43-0.50%之間， 各麻醉監測時間點之間無顯著差異。
3.2.4心電圖監測結果
從圖3-1中II導聯心電圖可以到，0min時P波時限為0. 04s,電壓小于0. 2mV, P-R間 期0. 08s, Q-T間期為0.20?0.30s, QRS波時限均在0. 05s以內，在整個監測過程未發生改 變；0min時QRS波幅小于0. 5mV,乳化異氟醚注后10min小型豬HR升至高，R波幅升高 超過0.2mV,隨后HR逐漸下降，節律減慢，R、S波幅在0. 8mV以下，到注藥后80min波 幅恢復0. 5mV以下。整個心電監測過程P波與QRS波群比例為1:1,心電圖波形以Rs為主， T波與QRS波方向一致，并且ST段沒有發生明顯偏移，QRS波時限均在0.05s以內，各波 振幅均在1mV之內。
圖3-1小型豬乳化異氟醚麻醉心電圖監測結果(縱坐標：gV；橫坐標：mm)
Fig.3-1 The result of ECG of miniature pigs anaesthetized by emulsified isoflurane (ordinate:
gV； abscissa: mm)
3.2.5腦電圖監測結果
從圖3-2腦電波圖可以看出，在正常狀態下小型豬FP1-A1和FP2-A2兩個電極監測到腦電 波為8~13Hz的a波，振幅20?100pV,兩個電腦波之間高度同步，證明麻醉藥物對兩個監測腦 區電位抑制程度很統一；從注藥后10?30min內，腦電圖兩個導聯電極都出現了頻率每秒4~8Hz 的。波，振幅均在100?150叩之間，兩個監測點電極電位變化有部分不同步，但差異不顯著； 在注藥后30~60 min出現了頻率0. 5?3Hz的6波，振幅在20?200口V之間，小型豬進入深度適中 的外科麻醉期，此過程兩個監測電極之間仍有很好同步性；在注藥后85min （停藥后5min） 腦電波轉為。波，開始出現麻醉前的高頻低幅的波型。
圖3-2小型豬乳化異氟醚麻醉腦電圖監測結果(縱坐標：gV；橫坐標：mm)
Fig.3-2 The result of ECG of miniature pigs anaesthetized by emulsified isoflurane
(ordinate: gV； abscissa: mm)
3.3乳化異氟醚麻醉中樞細胞信號轉導機制的研究
3.3. 1乳化異氟醚麻醉對中樞突觸體ATP酶活性的影響
3.3. 1. 1乳化異氟醚麻醉對大鼠不同腦區Na+-K+-ATP酶影響
大鼠尾靜脈以 2.7mL/kg.min 速度注射乳化異氟醚，在麻醉組大腦皮質、丘腦和海馬突 觸體Na+-K+-ATP酶活性抑制明顯，分別較對照組下降29. 03% (P<0. 05)、18. 48%(P<0. 05) 和34. 15% (P<0. 01)。恢復組中大腦皮質、丘腦和海馬突觸體Na+-K+-ATP酶的活性恢復到 正常水平，但大腦皮質Na+-K+-ATP酶活性較對照組仍有顯著差異(P<0. 05),海馬和丘腦與 對照組相比沒有顯著差異(P>005)。小腦及腦干突觸體Na+-K+-ATP酶的活性在麻醉前后與 對照組比較未發生明顯的變化。實驗結果見表3-6。
表3-6乳化異氟醚對大鼠不同腦區Na+-K+-ATP酶影響
(pmol Pi?mg-1 (prot) • h -1, X±SD , n=12) Table3-6 Effect of emulsified isoflurane on Na+-K+-ATPase activity in different brain regions
大腦皮質 小腦 海馬 腦干 丘腦
對照組 2.17±0.79 1.61±0.19 0.92±0.18 0.88±0.14 0.82±0.07
麻醉組 1.54±0.35 * 1.70±0.06 0.75±0.09 * 1.00±0.10 0.54±0.35 **
恢復組 1.59±0.33 * 1.64±0.20 0.89±0.03 0.93±0.08 0.71±0.05
注：**代表與對照組比較P < 0.01,差異極顯著；*代表與對照組比較P< 0.05,差異顯著。
Note: ** denote the difference compares with control group is extremely significant, P<0.01; *denote the difference compares with control group is significant, P<0.05.
從圖3-3可以看出，麻醉期大鼠大腦皮質、海馬、丘腦突觸體Na+-K+-ATP酶活性受到抑 制，恢復期酶活性趨近麻醉前，酶活性與麻醉深度變化具有一致性，而小腦和腦干中 Na+-K+-ATP 酶活性在麻醉前后沒有顯著性變化，與大鼠麻醉深度沒有相關性。
3.3. 1.2乳化異氟醚麻醉對大鼠不同腦區Ca2+-ATP酶影響
麻醉組大腦皮質、小腦、海馬、丘腦突觸體Ca2+-ATP酶活性與對照組相比降低了 52. 48% (P<0. 01)、23.72% (P<0. 05) 31. 65% (P<0. 05)和 20. 90% (P<0. 05),恢復組以上各腦 區突觸體 Ca2+-ATP 酶活性都有不同程度的恢復，小腦突觸體 Ca2+-ATP 酶活性回到對照組水 平，但大腦皮質、海馬和丘腦較對照組相比仍有顯著差異。在麻醉和恢復過程腦干突觸體 Ca2+-ATP酶活性未發生明顯的變化，沒有統計學差異。具體實驗結果見表3-7o
表3-7乳化異氟醚對大鼠不同腦區C^+-ATP酶活性的影響
(單位：口molPi/mgprot/hour, X±SD , n=12)
Table3-7 Effect of emulsified isoflurane on Ca2+-ATPase activity in different brain regions
大腦皮質 小腦 海馬 腦干 丘腦
對照組 2.02±0.77 1.56±0.39 0.79±0.23 0.75±0.10 0.67±0.02
麻醉組 0.96±0.34** 1.19±0.24* 0.54±0.13* 0.73±0.13 0.53±0.09
恢復組 1.54±0.33* 1.48±0.23 0.61±0.13* 0.74±0.14 0.59±0.11
注：統計分析標記同表 3-6。
Note: statistical analysis symbol is samilar to table 3-6.
從圖3-4中可以看出，麻醉期大腦皮質、小腦、海馬和丘腦突觸體Ca2+-ATP酶活性降低, 恢復時活性增強，其酶活性變化趨勢與麻醉深度變化具有同步性；腦干突觸體Ca2+-ATP酶活 性在麻醉期和恢復期均沒有顯著變化，其酶活性變化趨勢與大鼠麻醉深度沒有相關性。
圖3-4乳化異氟醚對大鼠不同腦區Ca2+-ATP酶活性影響趨勢圖
Fig.3-4 Tendency figure of emulsified isoflurane effect on the Ca2+-ATPase
activity in rats different brain regions
3.3. 1.3乳化異氟醚麻醉對大鼠不同腦區Mg2+-ATP酶的影響
大鼠注射乳化異氟醚后，在麻醉組大腦皮質和海馬突觸體Mg2+-ATP酶活性受到明顯抑 制，較對照組分別下降41. 03% (P<0. 01)和28.17% (P<0. 05),差異極顯著和顯著差異。 在恢復組大腦皮質突觸體Mg2+-ATP酶活性有升高趨勢，但與對照組相比(P<0.01),仍有 極差異顯著，海馬突觸體Mg2+-ATP酶活性在恢復組和對照組比較沒有顯著差異(P<0. 05)； 麻醉組和恢復組小腦、腦干和丘腦突觸體 Mg2+-ATP 酶與對照組相比差異不顯著。具體實驗 結果見表3-8。
表3-8乳化異氟醚對大鼠不同腦區Mg2+-ATP酶影響
(單位：^molPi/mgprot/hour, X±SD , n=12)
Table3-8 Efect of emulsified isoflurane on Mg2+-ATPase activity in diferent brain regions
大腦皮質 小腦 海馬 腦干 丘腦
對照組 2.34±0.21 1.67±0.16 0.71±0.08 1.04±0.06 0.76±0.15
麻醉組 1.38±0.18** 1.53±0.19 0.51±0.06* 1.11±0.13 0.79±0.08
恢復組 1.58±0.20** 1.63±0.26 0.74±0.06 0.99±0.18 0.70±0.08
注：統計分析標記同表 3-6。
Note: statistical analysis symbol is samilar to table 3-6.
Fig.3-5 Tendency figure of emulsified isoflurane effect on the Mg2+-ATPase
activity in rats different brain regions
從圖 3-5 中可以看出，乳化異氟醚注射后大腦皮質和海馬突觸體 Mg2+-ATP 酶活性受到 抑制，恢復期呈上升趨勢，其 Mg2+-ATP 酶活性變化趨勢與麻醉深度變化呈一致性；小腦、 腦干和丘腦Mg2+-ATP酶活性在麻醉前后均變化不顯著，酶活性與麻醉深度沒有相關性。
3.3. 2乳化異氟醚麻醉對中樞神經NO-NOS-cGMP信號轉導系統影響
3. 3. 2. 1乳化異氟醚麻醉對大鼠不同腦區NO產量的影響
麻醉組大腦皮質、小腦、海馬和腦干 NO 產量明顯下降，分別較對照組降低了 32.95% (P<0. 05)、36. 73% (P<0. 01)、33. 51% (P<0. 05)和 27. 71% (P<0. 05),恢復組大腦皮質、 小腦和海馬呈上升趨勢，恢復組大腦皮質和小腦NO產量與對照組沒有顯著差異(P>0. 05), 恢復組海馬和腦干NO產量超過對照組，較對照組仍有顯著差異(P>0.05)；在麻醉過程中 丘腦NO產量無明顯變化，沒有統計學上的意義。具體結果見表3-9o
表3-9乳化異氟醚對大鼠不同腦區NO產量的影響(gmol •gprot-1, x 士s, n=12) Table3-9 Effect of emulsified isoflurane on the NO production in rats different brain regions
大腦皮質 小腦 丘腦 海馬 腦干
對照組 2.58±0.29 2.94±0.21 1.53±0.24 1.94±0.25 1.66±0.27
麻醉組 1. 73±0. 22* 1.86±0.37** 1.63±0.27 1.29±0.27* 1. 20±0. 12*
恢復組 2.19±0.33 2.19±0.21 1.59±0.34 2.30±0.36* 2.15±0.23*
注：統計分析標記同表 3-6。
Note: statistical analysis symbol is samilar to table 3-6.
從圖3-6可以看出，麻醉過程中大腦皮質、小腦、海馬和腦干NO產量受到抑制，其產 量變化趨勢與大鼠麻醉深度變化具有同步性；而丘腦的NO產量在麻醉前后沒有統計學上變 化，其與麻醉深度沒有相關性。
3. 3. 2. 2乳化異氟醚麻醉對大鼠不同腦區NOS活性的影響
麻醉組大腦皮質、小腦、丘腦和海馬NOS活性較對照組呈下降趨勢，分別降低了 36. 39% (P<0. 05)、60. 45% (P<0. 01)、42. 75% (P<0. 05)和 34. 76% (P<0. 05),恢復組四個腦區 NOS活性均表現為上升，恢復組大腦皮質和小腦NOS活性超過對照組83.51% (P<0. 01)、 34.98 (P<0. 05)；恢復組丘腦NOS活性較對照組降低27. 48% (P<0. 05),恢復組海馬NOS 活性恢復至對照組水平；在麻醉過程中腦干NOS活性無明顯變化，沒有統計學上的意義。具 體結果見表3-10。
表3-10乳化異氟醚對大鼠不同腦區NOS活性影響(nmol?mg-1 (protein) •min-1, x 士s, n=6)
Table3-10 Effect of emulsified isoflurane on the activity of NOS in rats different brain regions
注：統計分析標記同表 3-6。
Note: statistical analysis symbol is samilar to table 3-6.
從圖3-7可以看出，麻醉過程中大腦皮質、小腦、海馬和腦干NOS活性變化趨勢為先下 降后上升，這與大鼠麻醉深度呈密切相關性；腦干的 NOS 活性在麻醉前后沒有統計學上變化 其活性變化與麻醉深度沒有相關性。
3. 3. 2. 3乳化異氟醚麻醉對大鼠不同腦區cGMP含量的影響
樣品通過ELISA試劑盒檢測，在酶標儀上測得各樣品的0D值見表3-11o
表3-11 cGMP標準品0D值檢測結果(n=2) Table 3-11 The OD value of cGMP standard substance
6.25 12.5 標準濃度(gmol •gprot-1)
25 50 100 200 400
OD 值 0.129 0.257 0.391 0.493 0.903 1.758 2.966
通過標準品數據求得：
標準曲線方程： Y=0.0072X+0.1713， R2=0.9928；
根據標準曲線，把各組樣品的0D值換算成濃度，統計分析后見表3-12o
大鼠注射乳化異氟醚后，在麻醉組大腦皮質和海馬cGMP含量顯著降低，分別較對照組 降低了 20. 58% (P<0. 05)和29. 61%% (P<0. 05)。而恢復組大腦皮質和海馬cGMP含量 上升，與對照組相比差異不顯著(P>0.05)；小腦、丘腦和腦干cGMP含量在麻醉前后有輕 微變化，但與對照組相比，沒有統計學上的變化。
表3-12 乳化異氟醚對大鼠不同腦區cGMP的含量的影響(pmol/100mg, x±s, n=6) Table 3-12 Effect of emulsified isoflurane on the cGMP content in rats different brain regions
大腦皮質 小腦 丘腦 海馬 腦干
對照組 18.22±0.42 19.45±0.66 19.27±0.47 18.71±0.42 18.36±0.49
麻醉組 14.47±0.38* 18.79±0.55 19.48±0.45 13.17±0.59* 19.41±0.51
恢復組 19.28±0.35 18.97±0.49 18.29±0.38 19.18±0.36 19.01±0.64
注：統計分析標記同表 3-6。
Note: statistical analysis symbol is samilar to table 3-6.
從圖3-8趨勢圖中可以看出，大腦皮質和海馬cGMP含量的變化趨勢與大鼠麻醉深度呈 密切負相關性，即隨著麻醉深度隨著cGMP含量的減少而加深，而小腦、丘腦和腦干的cGMP 含量變化趨勢與大鼠麻醉深度沒有相關性。
綜合各腦區NO產量變化、NOS酶活性變化和cGMP含量的變化，看出乳化異氟醚麻醉 后大腦皮質和海馬中NO產量、NOS酶活性和cGMP含量變化趨勢是一致的，表明大腦皮質 和小腦中NO-NOS-cGMP信號轉導系統參與了乳化異氟醚的麻醉過程，大腦皮質和小腦可能 是乳化異氟醚產生麻醉作用的主要靶位之一。
3. 4乳化異氟醚麻醉對NMDAR2B和nAChRa4表達的影響
3. 4. 1 不同腦區NMDAR2B和nAChRa4免疫組化空白對照實驗
在三個實驗組中隨機選擇了5張組織切片（包含大腦皮質、小腦、丘腦、海馬和腦干），
操作時不加一抗(加封閉液)，染色后結果顯示(圖 3-10)，所有切片細胞中未見染色細胞， 證明一抗特異性較強，實驗中未出現內源性過氧化物酶、堿性磷酸酶、自發熒光等物質引起 的非特異性顯色。
圖 3-10 免疫組化空白對照染色圖片
Figure3-10 Picture of blank control section staining in immunohistochemistry
3.4. 2不同腦區NMDAR2B陽性細胞表達分布和數量分析
(1)大腦皮質
NMDAR2B在大腦皮質區白質和灰質交接處細胞膜和胞質中表達；麻醉前NMDAR2B在 大腦皮質有少量陽性細胞表達，隨著麻醉深度增加陽性細胞數增加了 53.04%，與麻醉前比 較有極顯著差異(P<0. 01),在恢復期NMDAR2陽性細胞數量減少，較麻醉前增多，但無顯 著性差異(P>0. 05),陽性細胞數見表3-14o
(2)小腦
NMDAR2B在小腦梨狀神經元層的普氏細胞膜上表達，見圖3-11中M,但是在麻醉期 和恢復期陽性細胞數與麻醉前分布和數量無顯著差異(P>0.05),陽性細胞數見表3-14o
(3)丘腦
麻醉前NMDAR2B在丘腦視前區和視上區有少量陽性細胞表達(圖3-11中J),麻醉期 (圖3-10中K)和恢復(圖3-11中L)期陽性細胞數沒有發生明顯改變(P>0. 05),陽性細 胞數見表 3-14。
(4)海馬
NMDAR2B在海馬顆粒細胞層(齒狀回)細胞特異表達(圖3-11中D、E、F),麻醉前 陽性細胞數為 64.40±7.25 個，麻醉期陽性細胞數急劇減少到21.60±6.17個，較麻醉前有極 顯著差異(P<0. 01),恢復期陽性細胞數上升至48. 20±6. 38個，較麻醉前仍有顯著差異 (P<0. 05),陽性細胞數見表3-14o
(5)腦干
NMDAR2B在腦干網狀結構區細胞有少量陽性細胞(圖3-11中G、H、I),從麻醉前、 麻醉期到恢復期陽性細胞逐漸增多，在恢復期陽性細胞數較對照組有顯著性差異(P<0.05), 陽性細胞數見表3-14。
表3-14 不同腦區切片NMDAR2B陽性細胞數(X±SD, n=13)
Tab. 3-14 Number of NMDAR2B positive cell in rats different brain tissue slice
細胞數(個)
大腦皮質 小腦 丘腦 海馬 腦干
對照組 36.20±3.35 6.20±0.85 8.80±0.74 64.40±7.25 11.20±1.06
麻醉組 55.40±4.10* 6.80±0.74 8.20±0.83 21.60±6.17** 12.40±0.92
恢復組 42.80±4.42 6.60±0.88 8.40±0.86 48.20±6.38* 22.60±3.18*
注：統計分析標記同表3-6。
Note: statistical analysis symbol is samilar to table 3-6.
大腦
皮質
(400x)
對照組
麻醉組
恢復組
海馬
(400x)
腦干
(400x)
丘腦
(400x)
3. 4. 3不同腦區nAChRa4陽性細胞表達分布和數量分析
(1)大腦皮質
nAChRa4在大腦皮質區白質和灰質交接處細胞膜和胞質中表達；麻醉前在腦皮質中可鏡 檢到nAChRa4陽性細胞，麻醉組大腦皮質nAChRa4陽性細胞減少，較對照組有顯著差異 (P<0. 05)；恢復組nAChRa4陽性細胞數量恢復至對照組水平，見表3-15。
(2)小腦
nAChRa4在小腦梨狀神經元層的普氏細胞膜上表達，對照組小腦切片nAChRa4染色陽 性細胞極少，但是麻醉組和恢復組小腦切片中陽性細胞數分別為6.80±0.54個和5.60±0.69 個(圖3-12中K和L),較對照組都有極顯著差異(P<0. 01),陽性細胞數見表3-15o
(3)丘腦
麻醉前nAChRa4在丘腦有少量陽性細胞表達(圖3-12中M),麻醉期(圖3-12中N) 和恢復(圖3-10中0)期陽性細胞數沒有發生明顯改變(P>0.05),陽性細胞數見表3-15o
(4)海馬
nAChRa4在海馬顆粒細胞層表達(圖3-12中D、E、F),麻醉前陽性細胞數密度為 73.40±5.14 個，麻醉期陽性細胞數急劇減少為 32.60±6.39 個，較麻醉前有極顯著差異
(P<0.01),恢復期陽性細胞數恢復，較對照組無顯著差異(P>0.05),陽性細胞數見表3-15o
(5)腦干
nAChRa4主要在腦干網狀結構區細胞表達，對照組僅有少量陽性細胞(圖3-12中G), 麻醉組腦干切片中陽性細胞數為31.20±2. 89個(圖3-12中H),較對照組有極顯著差異 (P<0.01)；恢復組腦干nAChRa4陽性細胞數急劇減少(圖3-12中I),較對照組無顯著性 差異(P>0. 05),陽性細胞數見表3-15o
表3-15不同腦區切片nAChRa4陽性細胞數(X ±SD, n=15)
Tab. 3-15 Number of nAChRa4 positive cell in rats different brain tissue slice
細胞數(個)
大腦皮質 小腦 丘腦 海馬 腦干
對照組 34.80±4.10 2.20±0.18 3.40±0.43 73.40±5.14 8.60±0.85
麻醉組 22.60±3.12* 6.80±0.54** 3.20±0.45 32.60±6.39** 31.20±2.89**
恢復組 33.20±4.08 5.60±0.69** 3.40±0.44 69.00±7.20 11.40±1.07
注：統計分析標記同表 3-6。
Note: statistical analysis symbol is samilar to table 3-6.
3. 5乳化異氟醚麻醉對c-fos和c-jun蛋白表達的影響
3. 5. 1乳化異氟醚麻醉對c-fos基因蛋白表達的影響
NC膜轉印后經發光自顯影、曝光的X光片結果見下圖3-13。c-fos蛋白在62KD顯影, P-actin蛋白在42 KD處顯影，條帶較清晰，背景干擾小。
從表3-16可以看到，大鼠尾靜脈注射乳化異氟醚后，麻醉組大鼠大腦皮質、丘腦、海馬 和腦干中 c-fos 蛋白表達較對照組分別增加 15.32%(P<0.05)、525%(P<0.01)、187.23%
(P<0. 01)和71.43% (P<0. 01)；恢復組大鼠大腦皮質、丘腦、海馬和腦干中c-fos蛋白表 達減少，大腦皮質和腦干與對照組比較差異不顯著，而丘腦和海馬中 c-fos 蛋白表達仍高于 對照組 227.78%和 131.91%；麻醉組和恢復組中小腦 c-fos 蛋白表達與對照組比較，顯著差 異不顯著(P>0. 05)o
表3-16乳化異氟醚對大鼠不同腦區c-fos蛋白表達的影響(X±SD, n=6)
Tab. 3-16 Effects of emulsified isoflurane on the expression of c-fos protein in rats different
brain regions ( X ±SD, n=6)
大腦皮質 小腦 丘腦 海馬 腦干
對照組 1.24±0.05 0.58±0.02 0.36±0.03 0.47±0.02 0.28±0.06
麻醉組 1.43±0.06* 0.57±0.03 2.25±0.07** 1.35±0.04** 0.48±0.04*
恢復組 1.28±0.07 0.55±0.04 1.18±0.05** 1.09±0.04** 0.32±0.07
注：統計分析標記同表 3-6。
Note: statistical analysis symbol is samilar to table 3-6.
圖3-14乳化異氟醚對大鼠不同腦區c-fos基因蛋白影響趨勢圖
Figure 3-14 Tendency figure of emulsified isoflurane effect on
the on the c-fos gene protein in rats different brain regions
從圖3-14中可以看出，當大鼠注射乳化異氟醚后，除小腦之外，各腦區c-fos蛋白表達 增加，恢復組各區c-fos基因蛋白表達減少，表明c-fos基因是隨著麻醉深度的增加而表達增 加, c-fos參與乳化異氟醚全身麻醉過程，是乳化異氟醚全身麻醉作用的靶基因之一。
3. 5. 2乳化異氟醚麻醉對c-jun蛋白表達的影響
NC膜轉印后經發光自顯影、曝光的X光片結果見下圖3-15。c-jun蛋白在37KD顯影, P-actin蛋白在42 KD處顯影，條帶清晰，背景干擾小。
圖3-15大鼠腦組織內C-jun蛋白免疫印跡結果
Fig.3-15 Result of c-jun protein western blot in brain
大鼠注射乳化異氟醚后，麻醉組大鼠大腦皮質和丘腦 c-jun 蛋白表達減少，較對照組分 別減少13.95% (P>0. 05)和4.77% (P>0. 05),差異不顯著，恢復組大腦皮質和丘腦cjun 蛋白表達與對照組相比仍沒有顯著性差異。麻醉組小腦、海馬和腦干中c-fos蛋白表達增加， 分別增加89. 20% (P<0. 01)、669. 70% (P<0. 01)和50% (P<0. 05),有統計學上極顯著和 顯著差異；恢復組小腦、海馬和腦干中cjun蛋白表達減少，小腦和海馬與對照組相比仍有顯 著和極顯著差異，腦干中cjun蛋白表達與對照組沒有顯著差異。
表3-17乳化異氟醚對大鼠不同腦區c-jun蛋白表達的影響(X±SD, n=6)
Tab. 3-17 Effects of emulsified isofluran on the expression of c-jun protein in rats different brain regions ( X ±SD, n=6)
大腦皮質 小腦 丘腦 海馬 腦干
對照組 0.86±0.05 2.50±0.09 4.40±0.16 0.33±0.01 2.22±0.09
麻醉組 0.74±0.03 4.73±0.16** 4.19±0.12 2.54±0.05** 3.33±0.09*
恢復組 0.76±0.02 3.20±0.10* 3.99±0.12 1.45±0.05** 2.88±0.08
注：統計分析標記同表 3-6。
Note: statistical analysis symbol is samilar to table 3-6.
從圖3-16中可以看到，大鼠乳化異氟醚麻醉過程中和恢復期大腦皮質、丘腦c-jun蛋白 表達一直在降低，但與對照組大腦皮質和丘腦 c-jun 蛋白表達量相比無顯著性差異；乳化異 氟醚麻醉后大鼠小腦、海馬和腦干中c-jun蛋白表達顯著增加(P<0. 05或P<0. 01),在恢復 期降表達降低至麻醉前水平，表明小腦、海馬和腦干中 c-jun 基因可能參與了乳化異氟醚麻 醉調控過程，是乳化異氟醚全身麻醉作用的靶基因之一。
圖3-16乳化異氟醚對大鼠不同腦區c-jun基因蛋白影響趨勢圖
Figure 3-16 Tendency figure of emulsified isoflurane effect on
the on the c-jun gene protein in rats different brain regions
4討論
4.1實驗的整體設計思路
4.1.1關于麻醉劑的選擇
目前針對小型豬全身麻醉的麻醉劑已有幾種，但是在目前臨床推廣應用效果不好，遇到 了種種問題。分析主要原因是，臨床上往往把效果效果、可操作性、成本等綜合考慮，目前， 國家資助與大動物相關的課題項目越來越多，專家、學者把研究領域集中到克隆、轉基因動 物、干細胞方向上，這給國內實驗動物，也別是大動物實驗外科大戰帶來了巨大的推動作用， 應用而生的各種動物的實驗操作與保定和麻醉密不可分，所以安全可靠、易于操作和成本適 中的麻醉劑成為目前的需求熱點，針對目前動物麻醉劑市場的各種問題，課題組進行了多方 面的考察、分析，并進行了初期的一系列嘗試，為了能尋找到一種能滿足社會需求的理想麻 醉劑。目前的科研項目多數需要對動物進行有目的的保定和麻醉，所以不同項目，所要求達 到的麻醉效果均不相同，而且保定和麻醉的時間上也不一致，在進行較為復雜的心肺等實驗 外科操作需要麻醉的時間往往較長（3~5h不等）[170],在牙齒觀察、皮膚取樣、皮下放置跟 蹤器等造模等所需要的麻醉時間很短，往往30~60min即可[171],所以開發新型麻醉劑必須把 目前動物麻醉的現實情況進行細致研究，避免在成功開發之后進行推廣應用過程中夭折。
乳化異氟醚的開發和應用已有幾年的歷史，先前的研究主要圍繞模式動物（小鼠、兔、 實驗犬）進行了初步的麻醉嘗試，實驗證明乳化異氟醚經靜脈注射可以使動物達到麻醉狀態， 但是針對給藥速度和麻醉過程中的監測涉及很少，所以針對動物在麻醉過程中的效果和安全 性等均更沒有進行關注，后續主要研究傾向于乳化異氟醚對心肌、缺血再灌注等方向。這給 我們進行在大動物上麻醉嘗試給了很大提示，因為揮發性吸入麻醉藥，經靜脈途徑給藥與傳 統的吸入途徑給藥相比具有誘導迅速、麻醉可控性增加、成本低、對空氣污染小等優點，所 以我們進行了乳化異氟醚在小型豬麻醉中的嘗試，經過預實驗幾輪麻醉，最開始使用乳化異 氟醚進行麻醉誘導，誘導過程中需要經靜脈快速推入大量乳化異氟醚（1mL/kg）,部分小型 豬可以達到誘導麻醉效果，但是小型豬個體差異很大，部分動物出現了呼吸抑制和呼吸暫停， 有死亡現象發生，分析可能的原因，乳化異氟醚要使小型豬進入麻醉狀態，需要在血液中和 肺泡中有適宜的濃度，乳化異氟醚推入速度慢，通過血液經肺部呼吸代謝出去，達不到維持 麻醉的濃度；但是推注速度快，小型豬血液內和肺、肺泡內短時間內蓄積大量異氟醚，小型 豬能進入麻醉狀態，但是麻醉深度極不容易控制，所以我們選擇使用丙泊酚進行誘導，因為 丙泊酚是一種快速短效麻醉劑，而且和乳化異氟醚一樣都是通過靜脈給藥，這給誘導后麻醉 劑的持續補注帶來方便，經過誘導藥物的調整，課題組摸索出丙泊酚在小型豬誘導麻醉的劑 量，誘導后注入乳化異氟醚進行維持，經過速度精準靜脈輸液泵進行維持麻醉，進過幾輪麻 醉基本篩選出了乳化異氟醚小型豬的全身麻醉的最低輸注率和推薦劑量范圍。
4.1.2關于麻醉的監測方法
動物的麻醉監測主要以人為制定的一系列檢測標準來評判，監測標準源于麻醉劑的麻醉 后動物的共同表現，參考人類麻醉后的特征進行描述，當代動物麻醉監測更青睞于人類發明 的各種先進的監測儀器和設備，它們的出現和應用使原來模糊的機體內在變化得以直觀顯示， 為深入了解麻醉后復雜生理變化提供了便捷方法［172］。
動物的生物反射，如角膜反射、眼瞼反射、肛門反射等生物反射減弱和消失一直都做為 麻醉深度評定的主要手段之一［173］。通過對這些反射活動的監測能很好的評價麻醉深度，間接 可以判斷麻醉的安全性；本實驗采用了國際先進的 Datex-OhmedaS/5TM 型重癥監護儀、 IntelliVue MP20監護儀和Datex-Ohmeda呼吸監護儀對麻醉期間小型豬進行了連續動態監測， 具有以下的優越性：①可以大為節省人力、物力，保證試驗順利進行。②保證及時、連續地 報告監測結果，在監測點密集的情況下，保障了試驗數據的完整性和連續性。 ③監測儀器具 有報警功能，及時提醒試驗人員動物的異常情況，以便做出快速應對措施。監測設備可提供 的監測指標主要有：T、HR、RR、SPO2、MV、TV、PetCO2、CetlSO、MAC、無創血壓、 心電圖、腦電圖，這些指標包含了生命特征、呼吸循環、心功能、麻醉深度等方面，能夠很 好地反映出麻醉對正常生理機能的影響，通過對以上指標的監測可以較好的反映出對小型豬 麻醉效果。實驗中采用動物鎮痛、鎮靜、肌松等效果的監測方法，是根據動物生理特性及為 了滿足外科手術要求而進行設計的，并根據相應判定標準進行麻醉效果的綜合評價，較為直 觀、準確地反映出藥物對動物麻醉效果。
總之，麻醉監測方法的合理選擇對于麻醉藥物的選擇、麻醉效果評價、保障麻醉安全等 方面具有重大意義，麻醉監測是麻醉藥物研究的必要手段和評價麻醉藥效果的重要依據。
4.1.3關于麻醉機理實驗設計
全身麻醉的是麻醉藥通過不同途徑進入體內，達到鎮靜、催眠、制動和遺忘效果［174］。關 于全身麻醉藥的作用靶點和靶點藥物作用機制的研究，麻醉工作者進行了大量的實驗研究， 并提出了很多的假說、觀點。近年來，隨著細胞和分子生物學技術的發展，受體蛋白的分離、 純化、分子克隆以及鑒定等在全身麻醉作用部位及機制研究方面的應用，單獨在某個方面解 釋麻醉機理往往觀點和結論經不起推敲［175］。目前研究麻醉機理需要從多層次、多角度入手， 使得麻醉機理在組織、蛋白質、分子和基因方面有了更加深入的挖掘，大大增加了人們對全 身麻醉的認識深度。
1．乳化異氟醚靜脈注射可以使大鼠出現翻正反射消失，繼而進入麻醉期，停止注射后 30~50s,大鼠便恢復翻正反射和正常行走，從翻正反射恢復到自然行走的時間也有10~15s, 所以本實驗按照大鼠麻醉前后的三個重要時期設計分組，即對照組，僅注射脂肪乳；麻醉組， 大鼠完全進入外科麻醉期；恢復期，大鼠翻正反射剛開始恢復。相對應的麻醉深度為正常、 深麻醉和淺麻醉，希望通過實驗設計檢測乳化異氟醚麻醉三個時期各指標的相對變化，用以 闡明乳化異氟醚的全身麻醉機理。
2.本實驗中首先檢測麻醉后不同腦區突觸體ATP酶的產量活性和第二信使含量的變化， 通過對Na+-K+-ATP酶活性、NO產量、NOS活性和cGMP含量的檢測，從組織學上闡述乳 化異氟醚產生麻醉作用的機制，目前，通過對中樞信號轉導系統中ATP酶和第二信使成為研 究全身麻醉機制一個新的方向。
3.在細胞和亞細胞水平，全身麻醉作用可能發生在神經軸膜或突觸上，進而影響多種神 經信號的傳導而產生麻醉作用，配基門控和電壓門控的離子通道被認為是麻醉藥的主要作用 靶位，麻醉后神經突觸受體變化成為闡述麻醉機理的另一條路徑。常見的GABA受體、NMDA 受體、ACHRS受體、甘氨酸受體在解釋麻醉藥物的作用機制方面得到了廣泛關注，本實驗 檢測麻醉前后不同腦區 NMDA 和 nACHRs 受體表達變化，進而在細胞水平上來闡述乳化異 氟醚的全麻作用機制。
4.基因理論學說在解釋麻醉機理方面占據重要位置，隨著越來越多與麻醉相關基因的發 現、克隆和鑒定，使得麻醉機理得到了更加充分論證，成為麻醉領域的研究熱點。檢測全麻 藥物作用下中樞神經系統c-fos和c-jun表達變化可以發現與全麻作用相關的腦區核團，據此 可以描繪出一個參與麻醉信息傳遞的中樞通路，為揭示全麻機制提供新的思路。本實驗通過 檢測麻醉前后不同腦區c-fos和c-jun基因蛋白表達變化，論證c-fos和c-jun基因在乳化異氟 醚全身麻醉的調控作用。
4.2小型豬乳化異氟醚麻醉效果的評價
小型豬以最低輸注率靜脈注射乳化異氟醚，麻醉過程中體溫呈下降趨勢，但體溫下降是麻 醉的主要特征，動物沒有出現由于低體溫導致的循環系統功能下降以及蘇醒時間延長等現象。 生物反射中的眼瞼反射檢測，沒有出現躲閃、閉眼、眨眼等現象，證明小型豬處于臨床麻醉 階段；角膜反射檢測中小型豬有眼球收縮、顫動、眨眼等現象和肛門反射檢測中有明顯肛門 收縮，證明小型豬處于安全適宜的麻醉狀態；鎮痛效果監測中針刺和鉗夾檢測部位小型豬沒 有任何疼痛反應、鎮靜和肌松效果檢測中未出現目的反射動作，證明小型豬處于外科麻醉時 期，可以滿足臨床常規手術要求。
循環、呼吸系統是受麻醉藥物影響較為明顯的兩個系統，麻醉對這兩個系統的產生的抑 制作用，往往是發生麻醉意外及麻醉并發癥的主要原因之一［176］。監測循環、呼吸系統相關指 標可以客觀科學地評價麻醉方法及麻醉藥物對機體生理功能的干擾程度，也是評價麻醉安全 性的一個重要方面［177］。麻醉過程中小型豬 SpO2、SAP、DAP 和 MAP 的出現不同程度的變 化，但均在小型豬正常生理承受范圍內，吸入麻醉劑在維持麻醉過程中血氧飽和度下降是普 遍現象，因為麻醉劑揮發出氣體在肺泡內經氣體交換進入血液，隨血液流動至麻醉靶位，產 生麻醉作用，氣體在肺部的大量蓄積直接影響肺泡的氣體交換量，包括換氧量［178］。本實驗中 使用的乳化異氟醚靜脈注射，在肺部氣體的蓄積量會比吸入麻醉時更多，本麻醉中氧飽和度 在90%以上，小型豬不會出現缺氧狀況。血壓在注藥10min后SAP、DAP和MAP出現下降， 除了 MAP,沒有出現顯著差異，分析可能是注藥后10min,誘導藥丙泊酚在血液中有代謝殘 留，同時異氟醚在血液中濃度升高，此時血壓降低是丙泊酚和異氟醚共同作用的結果。在維 持過程中血壓與麻醉前相比均沒有顯著性差異，乳化異氟醚對小型豬循環系統未造成的干擾。
由于異氟醚對中樞呼吸系統具有抑制作用，在麻醉前后，MV和TV出現了較大波動， 主要由于呼吸頻率明顯降低導致，PetC02和CetlSO在注藥后10min增加，但在小型豬進入 穩定麻醉狀態后變化波動輕微，證明在維持麻醉過程中乳化異氟醚對小型豬呼吸系統未造成 損害。
心電圖在麻醉監測中可以用于發現各種心律失常、心室心房肥大、心肌梗死、心律失常、 心肌缺血等情況。在本實驗中，0min時P波時限為0. 04s,電壓小于0. 2mV, P-R間期0. 08s, Q-T間期為0.20?0.30s, QRS波時限均在0. 05s以內，在整個監測過程未發生改變；0min 時QRS波幅小于0. 5mV,乳化異氟醚注后10min小型豬HR升至高,R波幅升高超過0. 2mV, 隨后HR逐漸下降，節律減慢，R、S波幅在0. 8mV以下，到注藥后80min波幅恢復0. 5mV 以下。整個心電監測過程P波與QRS波群比例為1:1,心電圖波形以Rs為主，T波與QRS 波方向一致，并且ST段沒有發生明顯偏移，QRS波時限均在0.05s以內，各波振幅均在1mV 之內。結果表明乳化異氟醚對小型豬心功能有輕微影響，但是未發現異常波形和電位變化。
腦電圖作為檢測大腦皮層活動的最主要信號，在目前麻醉深度監測研究中處于主導地位 ［179］。本實驗腦電圖結果顯示，在麻醉前-初-中-后，腦電圖中表現出規律性的a-O-6-e波型變 化，并且相應波幅和頻率變化與傳統麻醉不同深度的腦電圖變化規律基本一致，表明乳化異 氟醚可以使小型豬達到理想的外科麻醉階段，并且麻醉深度是漸進的。
4.3乳化異氟醚全麻中樞細胞信號轉導機制的研究
4.3. 1大鼠不同腦區Na+-K+-ATP酶檢測結果評價
Na+-K+-ATP酶較為廣泛存在于機體各種細胞質膜，在興奮性和分泌性組織中活性很高， 其作用能夠逆濃度差主動地把細胞外液的K+移入膜內，同時不斷地把細胞內的Na+移出膜 外，因而形成和維持了 Na+,K+在膜內外正常的濃度差。在神經系統突觸體膜上也具有較高 的Na+-K+-ATP酶活性，此酶對突觸的化學傳遞以及神經傳導功能都具有特殊作用［180］。
麻醉組大腦皮質、海馬和丘腦突觸體 Na+-K+-ATP 酶的活性受到抑制，較對照組分別下 降 29. 03% (P<0.05)、18. 48%(P<0.05)和 34.15% (P<0. 01),差異顯著或極顯著。在 恢復組上述三個腦區突觸體 Na+-K+-ATP 酶的活性趨向恢復到對照組水平，但大腦皮質與對 照組相比仍有顯著差異(P<0. 05),海馬和丘腦與對照組相比差異不顯著(P>005)。腦干及 小腦突觸體 Na+-K+-ATP 酶活性在麻醉過程中未發生明顯的變化。結果表明，大腦皮質、丘 腦和海馬突觸體Na+-K+-ATP酶參與了乳化異氟醚產生全麻作用的調控過程。
以往的研究表明丙泊酚、異丙酚、氯胺酮、氯丙嗪、戊巴比妥、硫噴妥鈉、乙醇、異氟 醚等麻醉藥物對突觸體 Na+-K+-ATP 酶活性都有不同程度的抑制作用，并推斷抑制不同腦區 突觸體 Na+-K+-ATP 酶活性可是這些麻醉藥物產生麻醉作用的原因之一［181-183］。然而 Ratnakumari等（1997）在研究中發現，在離體的大鼠皮質突觸體給予25、100口mol異丙酚 對 Na+-K+-ATP 酶的活性無影響，這與胡興國等研究異丙酚對在體中樞神經組織突觸體 Na+-K+-ATP酶影響的實驗結果完全不同，這種結果的不同可能與實驗中劑量、突觸體所在組 織的狀況及實驗方法的不同有關［184］。馮征等（1998）為了闡明異氟醚對不同腦區突觸體 Na+-K+-ATP酶活性的影響，結果顯示：1. 5 MAC、2. 0 MAC異氟醚以劑量依賴的方式顯著 抑制皮質、海馬、腦干和小腦突觸體Na+-K+-ATP酶的活性（P<0. 01）o實驗證明異氟醚可能 通過對皮質、海馬、小腦、腦干突觸體 Na+-K+-ATP 酶的抑制，影響突觸興奮、突觸傳導和 突觸囊泡釋放神經遞質而發揮麻醉作用［185］o Dai Ishiwa等（2004）檢測了異氟醚和氯胺酮對 中腦黑質致密部K+-ATP酶通路的影響，結果證明3%異氟醚可以使表達K+-ATP的神經元發 生去極化，而對通路產生抑制作用，氯胺酮可以細胞內 K+-ATP 出現劑量依賴性的消除，實 驗證明這兩種麻醉劑可以抑制K+-ATP酶活性［187］o
本實驗乳化異氟醚麻醉后 Na+-K+-ATP 酶活性變化趨勢與文獻報道基本一致，在麻醉后 Na+-K+-ATP 酶活性降低，蘇醒后恢復正常水平。乳化異氟醚麻醉后，大鼠大腦皮質、海馬、 丘腦Na+-K+-ATP酶的活性較對照組呈抑制水平，小腦和腦干在麻醉前后Na+-K+-ATP酶的活 性沒有顯著性變化，可能與之前報道不一致，分析原因可能與檢測過程保證樣品酶活性的操 作上有差異，另本部分實驗課題組重復了兩次結果一致。不管是否部分腦區 Na+-K+-ATP 酶 活性是否有變化，但是腦酶活性普遍受到抑制是不爭結論，進一步證實了異氟醚可能通過 Na+-K+-ATP 酶活性的調節，影響突觸傳導、突觸興奮和遞質釋放。結合以上結果表明，對 Na+-K+-ATP 酶活性酶活性的抑制是乳化異氟醚發揮其麻醉作用的重要機制。
4.3. 2大鼠不同腦區Ca2+，Mg2+-ATP酶檢測結果評價
Ca2+, Mg2+-ATP酶，也稱Ca2+泵或Ca2+-ATP酶。腦Ca2+, Mg2+-ATP主要功能是消耗 ATP酶提供的能量將細胞內Ca2+泵至胞外或泵入胞內內質網，通過調節并維持神經元細胞胞 漿Ca2+的低穩態，在維持神經系統功能中發揮著重要作用［188］o細胞的多種功能都依賴于細 胞內外極高的Ca2+濃度差存在，鈣在細胞代謝反應中發揮著第二信使的作用。只要這種濃度 差減低，細胞就會受到功能性損傷，甚至死亡。Ca2+在細胞功能的調節中起著重要作用，例 如肌肉收縮、神經傳導、細胞分泌和增殖、細胞老化等許多細胞反應過程都需要Ca2+的調節 作用。首先是在細胞質與胞內鈣庫或胞外Ca2+之間存在濃度差異，這種差異是靠細胞膜上Ca2+ 轉移維持的，質膜鈣泵是維持鈣穩態的微調系統，在調節Ca2+濃度方面發揮著重要作用。當 腦內神經細胞興奮時，胞內Ca2+增加，Ca2+和CaM結合成Ca2+-CaM復合物，后者激活ATP 酶，將細胞內游離Ca2+泵出細胞，并促進游離Ca2+轉運入內質網和線粒體內貯存，由此降低 胞內Ca2+濃度，維持細胞內Ca2+的低穩態，從而保證神經細胞的正常興奮性［189］o
當前國內外關于異氟醚或乳化異氟醚對突觸體 Ca2+，Mg2+-ATP 酶活性影響的文獻報道 很少，黃雪珍等（2004）觀察異氟醚吸入麻醉期間大鼠各腦區Ca2+-ATP酶活性的動態變化， 結合行為學改變，探討異氟醚麻醉的作用機制。結果顯示麻醉組，大鼠大腦皮質、腦干、海 馬 Ca2+-ATP 酶活性分別降低 38.6%、43.2%、36.5%，與對照組比較僅有極顯著差異；恢復 期又開始回升，但是仍分別低于對照組水平；清醒期恢復至對照組水平（P>0?05）。大鼠各 腦區Ca2+-ATP酶活性改變與麻醉深度的變化趨勢相一致，與行為學變化相平行。研究非吸入 麻醉藥物對Ca2+, Mg2+-ATP酶活性影響的文獻報道也較少［190］。張志龍等（2003）研究顯示 氯胺酮麻醉會抑制大腦皮質和丘腦突觸體 Ca2+-ATP 酶活性［191］。劉煥奇（2004）等檢測噻拉 唑對腦區突觸體Ca2+, Mg2+-ATP酶活性變化，實驗中發現不同濃度的噻拉唑和QFM合劑可 以顯著抑制大鼠大腦皮質、小腦、腦干和海馬突觸體 Ca2+， Mg2+-ATP 酶的活性，并且酶活 性的抑制程度呈現出明顯劑量依賴性，酶活性變化趨勢與大鼠注射噻拉唑和 QFM 合劑后行 為學變化基本平行 ［192］。
本實驗中，麻醉后大腦皮質、小腦、海馬和丘腦 Ca2+-ATP 酶活性受到抑制，實驗中 Ca2+-ATP酶活性變化趨勢與麻醉深度保持同步。麻醉期大腦皮質和海馬Mg2+-ATP酶活性受 到抑制，其變化趨勢與麻醉深度變化一致。乳化異氟醚麻醉對Ca2+-ATP酶活性的影響結果與 之前異氟醚相關研究結果基本一致，乳化異氟醚麻醉通過抑制 Ca2+， Mg2+-ATP 酶活性產生 麻醉作用機制與其麻醉劑也基本相同。乳化異氟醚和異氟醚可明顯抑制大鼠大腦皮質、小腦、 丘腦和海馬Ca2+-ATP酶活性而發揮麻醉效應，麻醉深度與酶活性抑制的程度有關。
4. 3. 3乳化異氟醚對中樞神經系統NO-NOS-cGMP信號轉導系統影響
cGMP是一重要胞內信使物質，參與調節多種細胞功能，如Ca2+內流、遞質的釋放及攝 取，細胞膜的超極化或去極化等。研究發現，麻醉大鼠紋狀體中cGMP水平下降時，腦室內 注射二丁酰cGMP能抑制大鼠的抑制狀態，提示cGMP的變化可能與麻醉有關［194］。
本研究發現，乳化異氟醚麻醉后大鼠大腦皮質及海馬cGMP含量顯著降低，而cGMP水 平的降低一方面可通過調節cGMP依賴的蛋白激酶而影響特異蛋白的磷酸化，從而影響細胞 功能；另一方面由于cGMP能通過刺激水解cAMP的磷酸二酯酶（PDE）活性而直接調節cAMP 的水平。因此我們推測，麻醉后cGMP水平的降低可能導致對水解cAMP的PDE作用減弱， 從而使cAMP水平升高，這可能是麻醉是AC/cAMP系統上調的一個重要原因。有報道，NOS 抑制劑可抑制大鼠對麻醉劑鎮痛作用的阻斷，并減少一些阻斷癥狀的出現［195］。
至今為止麻醉對NO-NOS-cGMP影響的研究報道有許多，多數研究表明：麻醉藥能明顯 減少不同腦區NOS酶的活性和NO產生、cGMP的含量［196］。劉東等（1999）探討異氟醚麻 醉對大鼠不同腦區一氧化氮合酶（NOS）活性的影響，實驗發現異氟醚能劑量依賴性地抑制 大鼠小腦NOS活性，但對大腦皮質、腦干NOS活性的抑制作用不呈劑量依賴方式，結果表 明異氟醚對腦NOS活性的抑制作用存在腦區域上的差異［197］。胡云等（2004）動態觀察異氟 醚吸入麻醉大鼠不同時期脊髓一氧化氮合酶（NOS）活性和一氧化氮（NO）產量變化，誘導 期脊髓NOS活性和NO產量下降（P<0. 05或P<0. 01）；麻醉期降到最低水平（P<0.01）；恢 復期組開始上升，但較對照組仍有顯著降低；清醒期與對照組相比沒有差異（P>0.05）。大 叔行為學變化與NOS活性及NO產量變化密切相關［198］。實驗說明異氟醚可明顯抑制脊髓NOS 活性和NO產量，提示異氟醚可通過抑制NOS活性和NO產量而發揮麻醉鎮痛效應，麻醉深 淺與抑制的程度有關。
許多靜脈麻醉藥的作用機制可能涉及NO信息傳遞通路，其環節可能與改變cGMP依賴 的磷酸二酯酶的活性、改變NO的半衰期、阻止NO的釋放或對NOS的直接作用等方面有關 ［199］o本實驗中，NOS活性在麻醉后大鼠大腦皮質、小腦、海馬和丘腦中劑量依賴性地受到 抑制，說明在以上各腦區NO-NOS-cGMP信號轉導系統的調控機制是通過改變NO的半衰期、 阻止 NO 的釋放或抑制 NOS 的活性來抑制 cGMP 的產生，或者還有可能通過改變 cGMP 依 賴的PDE的活性以加速cGMP的降解來發揮其信息調控作用。
實驗中乳化異氟醚麻醉后大腦皮質、小腦、海馬和丘腦中NOS活性降低，與文獻中報道 異氟醚吸入麻醉基本一致，只是在單獨腦區抑制程度與文獻中出入，可能進行相關試驗時樣 品在收集和檢測過程由于外界環境和技術原因造成，準確的結果需要多次反復重復試驗才能 獲得。已知NOS作用下產生的NO,又可激活鄰近突觸前膜及突觸后膜部位的可溶性鳥苷酸 環化酶，刺激cGMP的產生，那么異氟醚麻醉后相應腦組織cGMP水平應是降低的，但本研 究結果中小腦和丘腦中卻并非如此。推測在中樞神經系統，乳化異氟醚除通過對 NO-NOS-cGMP 信號轉導系統自身環節的調控而誘導麻醉作用的產生外，還可能通過與其他 中樞神經傳導途徑相偶聯而共同調節麻醉作用的產生，但需進一步研究證實。總之，深入了 解NOS、NO與cGMP在麻醉過程中的各種內在關系，將有助于進一步闡明乳化異氟醚麻醉 機理的生化機制。
4. 3. 4乳化異氟醚對大鼠不同腦區NMDAR2B和nAChRa4表達的影
響
4.3.4.1 乳化異氟醚對大鼠不同腦區 NMDAR2B 表達的影響
在疼痛意識生成時，需要外界刺激信號達到某一閾值以上才可使中樞神經系統內谷氨酸 釋放增加，從而激活NMDA受體，所以疼痛意識的產生和不同的水平表現與NMDA受體通 道的開放有直接的關系［202］。
許多學者進行與NMDAR相關的麻醉試驗，苗青等(2010)檢測丙泊酚單次麻醉對成年 大鼠空間學習記憶能力的影響，以及對海馬 NMDA 受體 NR2A 亞基的變化的影響，結果丙 泊酚組較對照組平均學習潛伏期顯著縮短，靶象限活動時間百分比較對照組明顯延長，丙泊 酚組 NMDA 受體 NR2A 亞基的表達顯著增加，實驗表明，單次丙泊酚麻醉后，成年大鼠的 空間學習記憶能力提高，這種學習記憶能力的提高可能和 NMDA 受體 NR2A 亞基的表達上 調相關［203］。王恒林等(2010)建立可逆性膽堿酯酶抑制劑匹魯卡品誘發大鼠癲癇持續狀態 (SE)模型，觀察丙泊酚對SE大鼠海馬N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體亞型(NR2A、
NR2B)表達的影響，結果SE發作后24h,與BLK組相比，SE組大鼠海馬NR2A、NR2B亞 型的陽性表達量顯著增加(P<0105)；與SE組相比，丙泊酚組海馬NR2B表達顯著降低 (P<0105),而NR2A亞型表達無明顯變化。實驗表明丙泊酚對匹魯卡品誘發大鼠SE的抑制 作用可能與其下調NR2B亞型的表達有關［204］o Gerhard Rammes等(2009)使用異氟醚麻醉 小鼠，觀察海馬NMDARN2B亞單位表達情況，結果發現異氟醚麻醉后海馬NR2B的表達有
劑量依賴性增加趨勢［205］。Lana J. Mawhinney et al (2012)通過異氟醚和氧化亞氮麻醉大鼠， 觀察大鼠空間學習能力的修復和海馬NMDAR2B亞基的表達，結果證實海馬NMDAR2B蛋 白表達增加，NMDAR2B受體缺乏會導致空間學習能力下降［206］。
本實驗研究證明，乳化異氟醚麻醉后大鼠大腦皮質 NMDAR2B 增加，海馬 NMDAR2B 減少，海馬區麻醉后NMDAR2B表達減少與文獻中結論不一致，本實驗中通過免疫組化結果 清晰可見麻醉后NMDAR2B陽性細胞數急劇減少，乳化異氟醚經靜脈給藥其麻醉機理與吸入 麻醉可能有不同路徑，海馬區NMDAR2B表達減少有可能是異氟醚通過靜脈和吸入給藥產生 麻醉作用的不同之處，其準確性需要進一步實驗來證明。
4.3. 4. 2乳化異氟醚對大鼠不同腦區nAChRa4表達的影響
根據全麻藥對神經遞質、受體和離子通道的作用，以及它們在中樞神經系統的分布和功 能，可以推測全麻作用的產生。抑制谷氨酸能作用可出現記憶缺失、意識消失和制動作用的 全麻作用；調節神經型 nAchR 而致遺忘、鎮靜以及淺麻醉時的興奮，腦和脊髓內的 nAchR 也參與疼痛感覺的神經調控，抑制肌型n-乙酰膽堿受體(nAchR)使肌肉松弛而制動；按不同 亞基組成煙堿型乙酰膽堿受體分為肌肉型乙酰膽堿受體和神經型乙酰膽堿受體。肌肉型乙酰 膽堿受體介導機體神經沖動傳導和骨骼肌肌肉收縮。新生兒的骨骼肌神經肌肉接頭后膜乙酰 膽堿受體主要是肌肉型nAChR,隨著神經肌肉接頭發育完善，逐步被神經型nAChR所代替。 肌肉型nAChR和神經型nAChR在受體化學結構和電生理學上較大差異［207］。
之前一些學者做了相關研究，吳安石等(2005)觀察不同濃度異氟醚對大鼠海馬乙酰膽 堿釋放的影響，結果隨著異氟醚吸入濃度的增加，海馬透析液中Ach和Ch濃度均降低，停 吸1.4%異氟醚lh后仍較基礎值低(P<0. 05) ［208］。張勤功等(2005)探討普魯卡因靜脈麻醉 對中樞性乙酰膽堿釋放的影響，患者術前血中Ach活性明顯低于正常對照組(P<0.01),而 全麻狀態下Ach活性又低于術前Ach活性，當術后患者恢復意識時Ach活性又恢復到術前水 平，實驗證明普魯卡因等麻醉藥可使Ach的釋放受到抑制，麻醉時突觸的膽堿能釋放功能受 到抑制，麻醉蘇醒時該功能恢復正常［209］。趙雪蓮等(2007)通過重組受體，觀察丙泊酚對胎 兒型乙酰膽堿受體和神經型a 7a7-nAChR的作用，結果表明丙泊酚對細胞Y -nAChR和 a7-nAChR 都有抑制作用，抑制程度與丙泊酚的濃度無關［210］。 Tanxing Cui 等(2010)證明 nAChRa4p2在腦組織中廣泛分布，吸入麻醉劑(氟烷、異氟醚等)可以轉變成豐富的跨膜 蛋白，改變nAChRa4p2構象的多樣性，從而抑制nAChRa4p2通道功能［211］。Chih-Hung Lee 等(2011)通過實驗證明麻醉可以抑制nAChR的產生，但是機理不清楚［212］。Vasyl等(2013) 發現nAChRa4p2跨膜NMR結構上麻醉劑的結合位點，并通過實驗證明氟烷通過與該位點 結合來抑制nAChR的釋放來發揮其麻醉效應［213］。
本實驗結果與文獻中報道的異氟醚吸入麻醉對nAchR的影響不一致，本實驗中麻醉后大 腦皮質和海馬nAchRa4陽性細胞數減少，恢復期nAchRa4陽性細胞數增多，而麻醉后小腦 和腦干中nAchRa4陽性細胞數增多，在恢復期減少至正常水平，與文獻報道異氟醚廣泛抑制 各腦區結果不同，綜合結果發現這可能與nAchR受體亞型構象變化多樣性有關，Tanxing Cui 的實驗中檢測nAChRa4p2室一個極易活化并轉變結構的分子，在吸入麻醉后檢測時可能已 59
轉變存在形式而使nAChRa4p2測定量減少。此外nAchRa4在大鼠大腦皮質和海馬中的生物 學效應與其在小腦和腦干中不同，之所以大鼠表現出麻醉效應是不同腦區nAchRa4共同作用 的結果。
4.3. 5乳化異氟醚對不同腦區c-fos和c-jun蛋白表達的影響
4.3. 5. 1乳化異氟醚對不同腦區c-fos蛋白表達的影響
c-fos基因表達的fos蛋白作為第三信使與jun蛋白結合后回到核內調節其它靶基因轉錄， 將外界信號和基因的表型改變偶聯，參與許多生理、病理活動的調節［214］oo中樞部位c-fos基 因的表達作為藥物作用已被廣泛研究，其中麻醉劑對中樞腦區c-fos表達影響已經是麻醉劑引 起麻醉機制的研究熱點［215］。
以往的研究表明，多種麻醉藥單純給藥均可引起中樞神經系統 c-fos 基因的表達，但表 達的程度和部位有不同差異。研究表明，異丙酚能降低應激大鼠海馬、大腦皮質、下丘腦c-fos mRNA 表達水平，并與血漿促腎上腺皮質激素、皮質醇濃度下降一致；氯胺酮降低應激大鼠 海馬、大腦皮質c-fos mRNA表達水平，而對下丘腦c-fos mRNA的表達無顯著影響［216］。
本實驗結果表明，大鼠靜脈乳化異氟醚麻醉后引起大鼠大腦皮質、丘腦、海馬和腦干 c-fos 蛋白表達量增加，恢復期相應腦區 c-fos 蛋白表達降低，恢復到對照組水平；各組引起大鼠 各腦區c-fos蛋白表達的變化趨勢與藥物麻醉過程中行為學的變化基本一致。不同腦區的c-fos 蛋白表達量變化不一致，說明乳化異氟醚在中樞神經系統的作用部位上具有一定的選擇性和 差異性。本實驗結果證明乳化異氟醚靜脈麻醉可誘導不同腦區 c-fos 蛋白表達增加與異氟醚 吸入麻醉相關研究結果一致，進一步證明了 c-fos 在乳化異氟醚和異氟醚麻醉過程中的重要 調控作用。
4. 3. 5. 2乳化異氟醚對不同腦區c-jun蛋白表達的影響
全身麻醉在確定動物解剖學上的效應部位的主要研究手段是檢測c-fos和c-jun等基因的 表達。在中樞神經系統，各種刺激均迅速引起c-fos與c-jun過度表達，然后翻譯為fos與jun核 蛋白再進入核內對靶基因轉錄蛋白進行調節。用原位分子雜交方法檢測c-fos與c-jun的mRNA, 通過免疫組織化學方法檢測fos與jun核蛋白的表達，目前已應用于全麻機理研究中，成為認 識腦結構和功能的重要途徑［217］。
c-jun基因被視為具有在外界刺激，轉錄的信息傳導過程中發揮著核內第三信使的作用。 其表達產物JUN蛋白屬于磷酸化蛋白，該蛋白屬于AP-1家族成員之一［218］o c-jun原癌基因以回 文結構：5'-TGA (G/C) TCA-3'作為DNA特異性識別序列，可以結合在許多基因的啟動子上 參與基因轉錄的調控。JUN可與FOS蛋白、MAF蛋白、ATF蛋白及C-JUN的zipper區域結合形 成多種同源或異源二聚體。當外部條件刺激細胞膜上受體，從而激活第二信使(cAMP, Ca2+) 等，然后誘導c-jun基因轉錄mRNA,使其在胞漿內表達產物c-Jun又進入核內與c-fos蛋白在亮 氨酸拉鏈區(leucine zipper)形成同源或異源二聚體復合物，與靶基因的AP-1位點結合，最 后激活一些晚期基因轉錄，參與基因表達、細胞增殖與分化［219］。
研究發現c-jun可由于外界刺激等而立即轉錄出c-jun mRNA,翻譯為Jun核蛋白，作為核 內第三信使的作用，調節其他靶基因，參與細胞內信號級聯放大過程［220］，參與重要中樞系統 功能活動的信號轉導和調控過程。中樞部位c-jun基因的表達作為藥物作用位點已被廣泛研 究，其中麻醉劑對中樞腦區c-jun表達影響已經是麻醉劑引起麻醉機制的研究熱點。
以往的研究表明，多種麻醉藥物均能引起c-jun的高效表達，但有報道同一種麻醉藥物對 c-jun表達的影響有部位上的差異性。文欣榮(2004)設計高、中、低三個濃度梯度的異丙酚 對大鼠進行腹腔注射麻醉，然后利用免疫組織化學法檢測Jun核蛋白的變化，結果表明心肌細 胞Jun免疫反應陽性神經元表達明顯增多，表達的陽性神經元數量與異丙酚劑量呈現正相關 ［221］。尹寧(2005)研究異丙酚對心肌缺血再灌注的影響，研究結果表明，異丙酚可以明顯抑 制心肌細胞內Fos、Jun蛋白表達。七氟醚麻醉下小鼠腦內c-jun陽性神經元數量與行為學變化 (麻醉深度)呈現出明顯相關性，推測c-jun可能在全麻不同時程中發揮著一定的效應。七氟 醚能誘導大腦皮質、下丘腦背內側核、EW核、中央灰質、海馬CA1區、丘腦室旁核、丘腦腹 后外側核、黑質內側部、前連合/球內部、外側疆核部位c-jun基因的表達［222］。
本研究結果表明，靜脈注射乳化異氟醚后引起大鼠小腦、海馬和腦干c-jun蛋白表達增加， 與對照組比較顯著升高(P<0.05),恢復翻正反射后c-jun蛋白表達量恢復到對照組水平。結 果表明乳化異氟醚對c-jun蛋白表達影響與麻醉深度具有依賴性、一致性，c-jun基因參與了乳 化異氟醚麻醉調控過程。
5結論
1．乳化異氟醚以2.8 mL/kg.h 速度靜脈注射可以使小型豬維持理想的外科麻醉狀態。 2．乳化異氟醚麻醉對小型豬各項生理指標影響輕微，具有較高的安全性。
3.大腦皮質、海馬、丘腦突觸體Na+-K+-ATP酶；大腦皮質、小腦、海馬、丘腦突觸體 Ca2+-ATP 酶；大腦皮質和海馬 Mg2+-ATP 酶，在麻醉期活性顯著性降低，恢復期升高，它們 共同參與了乳化異氟醚全身麻醉的分子調控過程。
4.大腦皮質和海馬NO含量、NOS活性和cGMP含量變化趨勢一致，并且與大鼠行為 學變化基本吻合，表明大腦皮質和海馬中NO-NOS-cGMP系統參與了乳化異氟醚全麻作用的 分子調控過程。
5.大腦皮質、海馬、小腦和腦干中NMDAR2B和nAChRa 4可能是乳化異氟醚全麻作 用的靶位點。
6.大腦皮質、丘腦、海馬和腦干中 c-fos 基因與小腦、海馬和腦干中 c-jun 基因參與了 麻醉調控過程，可能是乳化異氟醚全麻作用的靶基因。
致 謝
在論文完成之際，衷心感謝我的導師王洪斌教授，從課題設計，技術路線，可行性和創 新性，具體實驗的每一步操作，到論文最終的修改和審定，均給予了悉心指導，使我的理論 水平和實驗技能方面都得到了充分的提高。導師在學術上嚴謹求實、學識淵博，生活中平易 近人、淡薄名利，科學中一絲不茍的科研作風、獻身科學的執著精神令我深感敬佩，他給我 教誨和啟迪將使我受益匪淺。值此畢業之際，向我的恩師致以最美好的祝福和最衷心的感謝。
感謝范宏剛老師在實驗過程和論文撰寫中給予的細致指導，還要特別感謝劉忠華教授、 高利教授、劉云教授、肖建華副教授在我學習過程中給予的指導、關心和幫助。衷心感謝張 建濤老師、馬海鹍老師在我實驗過程中給予的幫助和支持。
在實驗過程過程中，教研室的盧德章博士、姜勝博士、張華博士、張昊、楊同濤、王立 軍、侯金龍、宋旭東、李小波等碩士給予了無私的幫助，與你們一起學習生活的時光讓我終 生難忘。
感謝我的父母、愛人及單位的同事們，你們一直以來對我學業的支持、理解和鼓勵，是 我最強大的動力，在此表達我誠摯的謝意。
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